从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

在本视频文章中，利用逆转录病毒载体将人类成体成纤维细胞重编程为多能干细胞。首先，使用编码转录因子 T three four、SOX two、KLF four 和 cmic 的逆转录病毒载体转导人类成纤维细胞。

感染的成纤维细胞在小鼠胚胎饲养细胞上培养14至28天。随后用TRA 180 1抗体对获得的细胞培养物进行染色，以鉴定重编程细胞形成的克隆。阳性克隆随后被转移至含有MEF的培养板中进行扩增。

免疫细胞化学染色可确认多能性标志物的表达及多能干细胞系的建立。随后应进行额外研究以进一步表征这些细胞系。通常，刚接触体细胞重编程和人诱导性多能干细胞培养的研究人员会面临困难，因为难以准确识别正确的iPSC克隆集落。

本实验操作将由我实验室的博士后苏拉·波拉克博士（Dr. Sula Pollak）进行演示。首先，在10厘米培养皿中以每皿约700万至800万个细胞的密度接种Phoenix AMFO细胞，加入10毫升含高糖的DMEM培养基，放入培养箱中过夜培养。次日，配制转染混合液：在500微升无血清、含L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基中，加入12微克编码T34-SOX2、Klf4、c-Myc或GFP基因的载体质粒，以及35微升Fugene 6转染试剂。

将混合物孵育20分钟。然后，轻轻将DNA复合物用移液器加入含有Phoenix细胞的培养板中，细胞融合度应为70%至80%。在37摄氏度下孵育细胞6至8小时后。

吸去培养基，并加入8 mL含抗生素的高糖DMEM培养基。随后将培养板放回培养箱中继续培养12小时。使用移液器吸取并收集含有病毒的培养基。

然后更换培养基，并每12小时重复此过程，直至收集培养基四次。将收集的培养基置于4摄氏度保存。待所有培养基收集完毕后，合并所有部分，再通过0.45微米的管顶滤器倒入50毫升锥形管中，以去除脱落的细胞和碎片。

含有病毒颗粒的过滤培养基可在冰箱中保存两周而不丧失感染活性。不建议冷冻保存。在转导实验前一天，将冻存的成人人类成纤维细胞解冻，并向每孔六孔明胶包被板中加入1×10⁵个细胞。

第二天，在一个50毫升的锥形管中，分别加入3.5毫升的T4 SOX2、KLF4和c-Myc病毒培养基，并加入Polybrene，使其终浓度为6微克/升，作为对照。准备1毫升GFP病毒培养基、3毫升培养基以及Polybrene，使其终浓度为6微克/毫升。吸去含有人类成纤维细胞的培养板中的培养基。

然后加入 4 毫升混合病毒培养基或对照培养基，将培养板在 20 摄氏度下以 1600 ×g 离心 1 小时。离心后，将培养板孵育约 12 小时。随后将病毒培养基更换为成纤维细胞培养基，继续孵育 12 小时。

在最后一次感染后，再重复此过程两次，即从感染到在成纤维细胞培养基中培养。将成纤维细胞在DMEM中培养48小时。然后使用GFP逆转录病毒培养基检测平行转导的感染效率。

接下来，启动体细胞向多能细胞的重编程。将感染后的成纤维细胞接种于人胚胎干细胞培养基（HES培养基）中，或以每孔约2×10⁵个细胞的密度接种于经明胶处理的六孔板中，该六孔板预先以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层，并使用成纤维细胞生长培养基进行培养，次日更换培养基。

使用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 分散感染的人类成纤维细胞，并在成纤维细胞生长培养基中以每孔约 1.2 × 10⁴ 的密度接种。次日，将培养基更换为含有 0.5 mmol/L 丁酸钠的 HES 培养基，用于重编程的最初七天。

每天更换培养基。更换为不含丁酸钠的HES培养基，并继续重编程7至21天。每天均需更换培养基。

观察转导细胞的形态学变化。将转导的成纤维细胞接种到饲养细胞上约10天后，细胞克隆将开始出现。含有重编程细胞的克隆现在被称为人诱导性多能干细胞或人iPS细胞。

人iPS细胞集落在接种于MEF饲养细胞后14至28天即可准备进行分离。在此阶段，人iPS细胞集落可转移至含MEF或包被Matrigel的培养板中。以下演示在挑取人iPS细胞集落前一天，将经γ射线照射的MEF饲养细胞以成纤维细胞生长培养基接种于24孔板中的操作。

在拟挑选人iPS细胞克隆的当天，将培养物置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育。吸除MEFs上的成纤维细胞生长培养基，并用PBS洗涤以去除残留的胎牛血清（FBS）。随后，向每孔加入0.5毫升含10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632的人胚胎干细胞（hESC）或HES培养基。接着，在超净台内使用显微镜观察重编程培养板中人iPS细胞克隆的形成情况。

如有必要，使用21号针头去除人iPS细胞集落周围的成纤维细胞。用PBS洗涤培养板，加入含有TRA-1-80活细胞特异性抗体的新鲜HES培养基。将细胞放回37摄氏度、5% CO2的培养箱中继续培养。

30分钟后，将培养基更换为新鲜的HES培养基，其中添加10 µM的ROCK抑制剂。然后在荧光显微镜下观察集落，标记TRA-1-81阳性的集落。

使用21号针头作为客观标记。将TRA 180 1阳性人类iPS细胞集落切割成若干小块。接着，使用自动移液器将人类iPS细胞集落的片段转移至含有MEFs的24孔板的各个孔中。避免转移非iPS细胞。

将培养板放入培养箱中，使人类诱导多能干细胞（iPS细胞）集落贴壁生长24至36小时，每天更换培养基。在初次转移至24孔板后48小时，可观察到具有正确拟胚体样形态的人类iPS细胞集落。每六至八天通过21号针头切割法对人类iPS细胞集落进行人工传代，并在克隆扩增后将培养物逐步扩增至12孔板，随后转移至6孔板。

在建立人诱导多能干细胞（iPS）系后，通过免疫化学方法分析其多能性标志物的表达，包括TRA-1-60、SSEA-4、T3-4、SOX2和Nanog。详细的表征可能包括体外和体内分化分析、核型分析、转基因沉默分析、甲基化研究以及基因表达研究。

含有逆转录病毒的培养基进行高效转导对于成功重编程及确定病毒转导效率至关重要。来源于弗里德赖希共济失调症患者的成人成纤维细胞，在连续两次感染表达GFP的逆转录病毒培养基后进行观察：当成纤维细胞仅通过与病毒培养基简单孵育感染时，转导的细胞比例不到20%。然而，当在加入GFP逆转录病毒培养基后立即进行后续操作，转导效率显著提高。

此处超过80%的细胞被转导，以对分离的人诱导多能干细胞（iPS细胞）克隆进行初步表征。通过免疫化学方法检测了人胚胎干细胞特征性的多能性标志物的表达，结果如图所示。分离的人iPS细胞克隆对多能性标志物呈阳性。

T三、四、SOX2纳米、SSEA-4和TRA-1-60 DNA。上图面板中通过DPI共染色显示，在人iPS细胞克隆和饲养层细胞中均可检测到。这些结果表明，采用该重编程方案获得的人iPS细胞表达了未分化人多能干细胞特征性的多能性标志物。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用逆转录病毒转导技术成功地将人类成纤维细胞重编程为多能干细胞，正确识别人类诱导性多能干细胞克隆，并对hiPSCs进行初步表征。