Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a resposta celular à hipóxia em agregados celulares encapsulados em PEG. Na primeira etapa, células dispersas são infectadas com o vírus marcador e então cultivadas em agitador para permitir a formação de agregados. Em seguida, o PEG linear é funcionalizado e o iniciador PEG DM é purificado.

Em seguida, os agregados celulares são encapsulados em um hidrogel de PEG DM. Por fim, os hidrogéis são cultivados em diversas condições de oxigênio enquanto são monitorados por fluorescência quanto ao sinal do marcador de hipóxia. Em última instância, a localização e a extensão da atividade do fator indutível por hipóxia em agregados celulares viáveis encapsulados podem ser visualizadas por meio de microscopia fluorescente simples.

Esse método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de encapsulamento celular e entrega terapêutica baseada em células, tais como: Onde ocorre a hipóxia em culturas tridimensionais, e como ela afeta a sobrevivência e a função celulares? As implicações dessa técnica estendem-se às abordagens de medicina regenerativa e ao tratamento de deficiências hormonais, como diabetes mellitus, devido ao grande impacto da hipóxia em tecidos agregados e encapsulados. A atividade do fator induzível por hipóxia um (HIF-1) tem sido associada à redução acentuada na secreção de insulina por células beta, o que motiva tentativas de dissociar ilhotas primárias e reorganizá-las em pseudo-ilhotas.

Agregados de diâmetro reduzido. Nossa marcação pode indicar a atividade do fator induzível por hipóxia com agregados em nível celular dentro de qualquer material encapsulante solto. O PEG foi escolhido como material da cápsula devido às suas propriedades favoráveis de transferência, compatibilidade citológica e à facilidade com que pode ser funcionalmente modificado.

Após pesar dois gramas de PEG em um frasco de vidro de 40 mililitros, adicione aproximadamente 308 microlitros de metacrilato de anidrido e feche parcialmente o frasco com uma tampa de plástico rígido. Submeta o frasco a irradiação em forno de micro-ondas comum em potência máxima por dois minutos. Em seguida, utilizando luvas resistentes ao calor, agite completamente o frasco em vórtex e irradie a solução novamente em potência máxima por cinco minutos adicionais.

Deixe o frasco esfriar brevemente o suficiente para ser manipulado e, em seguida, destampe-o enquanto gira o frasco. Adicione lentamente cloreto de metileno, fazendo vortex da amostra conforme necessário até que a solução pareça clara e homogênea. Em seguida, adicione a solução gota a gota em 200 mililitros de éter dietílico frio sob agitação para precipitar o PEG dm.

Em seguida, colete o DM de PEG por filtração a vácuo e deixe secar. Uma vez que o DM de PEG estiver seco, dissolva-o em cerca de 100 a 150 mililitros de água desionizada. Em seguida, diализar a solução contra água desionizada por cinco dias em tubos de diálise com limite de peso molecular de 1000 Daltons após a diálise.

Transfira a solução para recipientes apropriados e congele-a a menos 80 graus Celsius durante a noite. Em seguida, liofilize a solução por quatro dias para gerar um pó branco purificado de PEG DM para liberar as células da superfície do frasco de cultura tratado. Primeiro, aspire o meio, lave as células com HBSS sem cálcio e magnésio a 37 graus Celsius e aspire o HBSS.

Agora, adicione dois mililitros da solução de tripsina e EDTA a 37 graus Celsius e deixe as células incubarem a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, bata firmemente na lateral do frasco para desprender as células, adicione oito mililitros de meio a 37 graus Celsius ao frasco e pipete vigorosamente a suspensão celular para cima e para baixo, tomando cuidado para não introduzir bolhas.

Após transferir a solução celular para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, conte as células utilizando um hemocitômetro para determinar o número total de células a serem infectadas. Adicione o volume necessário de suspensão celular para obter 400.000 células por poço nos poços de uma placa de cultura em suspensão de seis poços; alíquota 50 microlitros de HBSS por poço de células a serem infectadas em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitro. Em seguida, pipete cuidadosamente a quantidade adequada de suspensão viral na HBSS preparada.

Agora, adicione o volume apropriado do vírus diluído em cada poço para atingir a MOI desejada e, em seguida, adicione meio a cada poço para elevar o volume total a 1,7 mililitro. Por fim, coloque a placa sobre um agitador orbital dentro do incubador, ajuste o agitador para uma velocidade baixa de cerca de 100 rpm, de modo que o meio lave suavemente o interior dos poços, e deixe as células agregarem por 24 a 36 horas. Comece cortando a ponta cônica de uma seringa plástica de um mililitro e coloque-a com a extremidade aberta voltada para cima em um suporte, criando um recipiente no qual o hidrogel será formado.

Em seguida, pipete 20 microlitros da solução fotoativa de PEG DM na extremidade aberta da seringa, sobre o êmbolo, certificando-se de que o volume cubra toda a superfície do êmbolo. Ajuste o êmbolo em pequenos incrementos para obter uma superfície plana do líquido. Agora, coloque a pipeta de volta no suporte e posicione o suporte sob uma lâmpada de UV por aproximadamente oito minutos para permitir a reticulação do hidrogel.

Neste período, pipete o volume contendo o número desejado de células e agregados em um tubo microcentrífugo de 1,8 mililitro. Tampe o tubo e, em seguida, centrifugue as células e agregados por cinco minutos a 130 ×g. Em seguida, utilizando uma micropipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular na ponta do tubo.

À medida que a ponta do meio se aproxima do pellet, utilize uma ponta de pipeta mais fina de 10 microlitros, distribuindo uniformemente os agregados celulares por toda a solução precursora do gel, garantindo que eles estejam completamente encapsulados. Esta é a parte mais delicada deste procedimento. Ao realizar este passo, tenha cuidado para ressuspender e transferir o pellet suavemente.

Agora, ressuspenda suavemente o pellet celular em 20 microlitros da solução fotoativa de PEG DM. Utilizando uma ponteira de boca larga, adicione a suspensão celular à seringa sobre a porção de hidrogel reticulado e exponha a seringa a mais oito minutos de luz UV para concluir a construção do hidrogel. Ao finalizar, as células devem estar completamente encapsuladas dentro do hidrogel cilíndrico.

Por fim, adicione um mililitro de HBSS em um poço de uma placa de 24 poços e um mililitro de meio em outro. Em seguida, ejetar o hidrogel da seringa para dentro do HBSS para lavar brevemente o gel. Transfira o gel para o meio e cultive a placa sob as condições desejadas.

Em qualquer momento durante o cultivo, as células podem ser visualizadas usando microscopia fluorescente para acompanhar o início do sinal hipóxico; coloque a placa de 24 poços sobre a platina do microscópio, centralizando o poço com o hidrogel sob a objetiva. O sinal é específico o suficiente para identificar células sinalizadoras individuais, mas a resolução pode ser inadequada para determinar a localização intracelular do sinal. Em células sinalizadoras, o sinal é tipicamente observado de forma uniforme por todo o citoplasma.

Esta figura mostra um exemplo representativo de agregados minx encapsulados em um hidrogel de PEG dentro da célula de gel. Os agregados devem estar completamente envoltos na matriz e distribuídos de maneira homogênea para permitir um melhor transporte de nutrientes, como visto aqui. Observe como o gel reticulado é sólido por completo, assumindo a forma do recipiente no qual a reação foi realizada.

Nesta figura, é mostrado um sinal fluorescente representativo de hipóxia em agregados de células min six em um hidrogel de PEG DM, células essas que foram encapsuladas e então colocadas em incubação a 20% de oxigênio por 44 horas. As células mostradas à esquerda não exibem sinalização de hipóxia, enquanto as células que foram encapsuladas e então incubadas a 2% de oxigênio por 44 horas, como mostradas à direita, exibem um sinal claro e ubíquo. A hipóxia também pode ser monitorada em outros tipos celulares.

Esta figura mostra a sinalização hipóxica representativa em agregados de células-tronco mesenquimais encapsulados. Como observado na figura mais à esquerda, o sinal fluorescente não é detectável após 12 horas em 2% de oxigênio; em seguida, conforme visto na figura central, torna-se mais aparente após 24 horas em 2% de oxigênio. E finalmente, como visto na direita, é altamente expresso após 96 horas em 2% de oxigênio, seguindo este procedimento.

Outros métodos, como ELISA, análise de proteínas secretadas e ensaios de viabilidade celular, podem ser realizados para correlacionar a sinalização hipóxica com o fenótipo celular. Com esse avanço, essa técnica poderá abrir caminho para pesquisadores nas áreas de engenharia de tecidos e terapia celular baseada em entrega de células explorarem a função de sobrevivência e a diferenciação de células dentro de estruturas tridimensionais e materiais de encapsulamento.