Purificação de vacúolos patógeno de Legionella Infectados Fagócitos

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar legionella intacta contendo VAEs ou LCDs de fagócitos infectados. Isso é conseguido primeiro homogeneizando os fagócitos infectados com um homogeneizador de esferas de aço inoxidável. Durante a segunda etapa, o homogeneizado é incubado com um anticorpo primário que visa especificamente uma proteína efetora bacteriana localizada na membrana LCV, seguida de incubação com um anticorpo secundário acoplado a esferas magnéticas.

Em seguida, o anticorpo decorado lc vs. São retidos por um campo magnético e depois lavados e aludidos. Em última análise, os LCDs magneticamente enriquecidos podem ser purificados ainda mais por centrifugação com gradiente de densidade.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que as características moleculares específicas do compartimento dos parasitas infectados podem ser exploradas para purificar bactérias patogênicas intactas. Quatro dias antes do isolamento do LCV, o DS red express produzindo legionella pneumophila a partir de estoques de glicerol em placas de trado de extrato de levedura de carvão com cinco microgramas por mililitro. Cloranfenicol incubar a bactéria a 37 graus Celsius um dia antes da infecção CDA uma vez 10 elevado ao sétimo Calnexina GFP produzindo Dium Disco Dium em frascos de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados incubar a ameba em 10 mililitros de HL cinco meio com G quatro 18 a 23 graus Celsius no dia anterior ao experimento inocular um tubo de ensaio de 15 mililitros contendo três mililitros de meio YE e cinco microgramas por mililitro de cloranfenicol com aproximadamente 100 mililitros de uma suspensão L pneumophila.

Para produzir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,1, incube a cultura durante a noite em uma roda de rotação a 37 graus Celsius por 21 a 22 horas antes de iniciar o isolamento. Primeiro, mude o meio das células de dedis qadium para remover o antibiótico. Agora meça a densidade óptica da cultura noturna de L pneumophila diluída de um a 10, que deve estar em torno de 0,3.

Em seguida, transfira aproximadamente 500 microlitros da suspensão de L pneumophila para cada frasco para infecção das células dsco Dium sincronize a infecção centrifugando as bactérias nas células por 10 minutos a 500 vezes G e 25 graus Celsius, seguido de uma hora. Incubação das células dqu dium a 25 graus Celsius. Após a infecção.

Remova o meio e lave a ameba uma vez com tampão de fonte C gelada. Para remover qualquer bactéria extracelular, adicione três mililitros de tampão HS suplementado com inibidores de protease a cada frasco e, em seguida, use um raspador de células para coletar as células. A homogeneização das células infectadas é a parte mais complicada do procedimento.

O sucesso depende de um homogeneizador de esferas de aço inoxidável meticulosamente limpo, do tamanho correto de exclusão do homogeneizador de esferas, de um número ímpar de golpes e da quantidade de pressão aplicada. Depois de agrupar as amostras correspondentes em um tubo de ensaio de 15 mililitros, lave um homogeneizador de esferas de aço inoxidável com uma bola de folga de oito mícrons com água destilada e, em seguida, lave o homogeneizador com tampão hs gelado. Agora encha uma seringa de plástico LOR de três mililitros com a alíquota de três primeiros mililitros da solução celular e monte a seringa no homogeneizador.

Pressione a amostra para frente e para trás nove vezes através do homogeneizador e, em seguida, colete a amostra homogeneizada em um novo tubo de ensaio de 15 mililitros. Descarte a seringa usada e monte uma nova. Depois de agrupar toda a amostra homogeneizada, transferir um Eloqua de 150 microlitros para um tubo einor para análise posterior.

Em seguida, bloqueie o homogeneizado com soro de bezerro a 2% por 30 minutos no gelo em uma coqueteleira. Depois de bloquear o vórtice, um anticorpo primário contra qualquer marcador bacteriano que se liga exclusivamente à membrana LCV e, em seguida, incuba a amostra com o anticorpo no gelo em um shaker por uma hora. Enquanto isso, adicione 5,75 mililitros de uma solução de histo den a 35% a um tubo cônico fresco de 15 mililitros.

Cubra cuidadosamente 5,75 mililitros de uma solução de histo den a 10% e, em seguida, coloque os tubos horizontalmente por uma hora em temperatura ambiente. Agora pellet o homogeneizado bloqueado e tratado com anticorpos por 15 minutos a 600 vezes G e quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de tampão HS e, em seguida, transfira a amostra para um novo tubo de ensaio de 15 mililitros.

Em seguida, vórtice o anticorpo secundário e, em seguida, incube o homogenato com o anticorpo secundário e, em seguida, coloque a amostra no gelo em um shaker por 30 minutos. Enquanto isso, coloque a coluna apropriada no suporte magnético máximo e equilibre a coluna com meio mililitro de tampão HS. Após 30 minutos, aplique a amostra à coluna observando a coluna três vezes com hs buffer.

Em seguida, remova a coluna do ímã e aluda ao lc vs. Com 0,5 mililitros hs. Amortecedor por mergulho imediato.

Agora, gire lentamente os tubos de gradiente de histo dens de volta para a posição vertical e carregue cuidadosamente o elu por cima. Centrifugue os tubos por uma hora a 3.350 vezes G e quatro graus Celsius. Finalmente, use uma pipeta de pastagem de vidro longo para coletar oito frações de 1,5 mililitro do fundo de cada tubo de 15 mililitros e coloque as alíquotas em tubos eph.

Transfira 150 microlitros de cada fração de gradiente de densidade contínua para tubos EPI DPH para análise posterior. Comece colocando lamínulas revestidas de poli L lisina em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 24 poços. Pipete as amostras colocadas de lado durante o isolamento do LCV nos poços e adicione 0,5 mililitros de tampão HS para diluir a centrífuga de alta concentração de extremidades histo.

A placa de 24 poços por 10 minutos a 600 vezes G e quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, fixe as amostras com 4% par de formaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente após a fixação, lave as amostras duas vezes com a fonte C e, em seguida, monte as amostras em lâminas de vidro com o meio de montagem apropriado. Por fim, analise as amostras com um microscópio fluorescente equipado com os filtros apropriados.

Esta primeira figura mostra uma visão geral representativa das amostras coletadas durante o isolamento do LCV das idades de dsco, dium ou macrófagos. O homogeneizado de fagócitos infectados com L Pneumophila contém lc intacto vs. Mas também muitos detritos celulares e bactérias extracelulares após a peletização.

A solução celular. O conteúdo da amostra de reserva é semelhante ao do homogeneizado, embora às vezes um pouco mais denso, como visto aqui. O fluxo através da coluna magnética contém principalmente bactérias extracelulares e detritos celulares, uma vez que lc intacto vs.

Deve grudar na coluna depois de iludir a amostra da coluna. O eluído contém grandes quantidades de lc intacto vs. Após a centrifugação da densidade histológica.

A purificação do VCL parece ser mais eficaz para o dsco dium do que para macrófagos com dsco dium. Os patógenos VAEs parecem mais redondos e o rendimento de l cvs isolados é mais de 10 vezes maior em comparação com macrófagos em macrófagos intactos lc vs. Corados com diferentes anticorpos também aparecem de forma mais irregular Após o procedimento de risco.

Outros métodos, como proteômica ou microscopia de imunofluorescência, podem ser realizados para caracterizar em detalhes os componentes da célula hospedeira e bacteriana das DSTs.