El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método estandarizado para la investigación experimental con células madre en el campo de la reparación osteocondral. Esto se logra aislando primero las células madre mesenquimales de la médula ósea de conejo. En el segundo paso, las células madre aisladas se cultivan para facilitar la proliferación.

A continuación, se fabrican los coágulos de células de fibrina in vitro. Finalmente, los coágulos de células de fibrina preestablecidos se implantan en defectos osteocondrales artificiales en la articulación de la rodilla de conejo. Finalmente, después de 12 semanas in vivo, se puede realizar un análisis macroscópico de la rodilla con el tejido de reparación mostrando una superficie homogénea e intacta con una textura sólida.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las lesiones del cartílago en un entorno animal de experimentación, ya que permite el análisis in vivo de la capacidad de integración y regeneración de las células madre mesenquimales alogénicas para el tratamiento del daño del cartílago. En la sala de cirugía, use un par de maquinillas eléctricas para afeitar el pelaje de las extremidades traseras y el vientre de un conejo sacrificado, y simultáneamente aspire el pelaje después de desinfectar el área afeitada a fondo con etanol al 70%. Haga una incisión a lo largo de la superficie craneal de la pierna y la pantorrilla, y luego refleje la piel y el tejido subcutáneo mediante una disección aguda.

A continuación, separe los músculos y ligamentos de la tibia y el fémur, manteniendo los cortes lo más cerca posible del hueso para una disección limpia. A continuación, corte la articulación de la cadera para separar la cabeza del fémur del acetábulo y elevar el complejo femoral tibial. Ahora use la hoja del bisturí para raspar cualquier tejido blando restante de los huesos.

A continuación, corta la rótula y los ligamentos de la articulación de la rodilla para separar finalmente los huesos de la pierna. Rocíe los huesos separados con etanol al 70% después de que se hayan secado al aire. Coloque cada hueso en tubos de centrífuga separados de 50 mililitros que contengan medios de cultivo celular para mantenerlos húmedos en un cultivo celular estéril.

Campana de flujo laminar. Use pinzas estériles para transferir los huesos recolectados de los tubos de centrífuga a platos de 150 milímetros. A continuación, utilice una sierra estéril para extraer ambos extremos del hueso y trasladar las piezas a nuevas placas de 150 milímetros.

A continuación, llene una jeringa de 10 mililitros con medio. Coloque una aguja de calibre 18 e inserte la punta de la aguja en un extremo del hueso en la médula. Ahora enjuague la cavidad de la médula con un medio para enjuagar la médula ósea en el plato.

A continuación, aspire la suspensión celular en la jeringa y enjuague la médula ósea repetidamente hasta que la suspensión esté libre, flote a través de la cavidad de la médula ósea y no aparezcan más coágulos de médula ósea. Una vez que se haya recolectado la médula ósea de todos los huesos, llene la jeringa con la suspensión de médula ósea a través de la aguja y fuerce la suspensión de médula ósea hacia el medio para interrumpir los grumos de médula. Posteriormente, pase la suspensión a través de un filtro de celdas a un tubo de 50 mililitros para evitar la pérdida de celdas.

Lave la placa de cultivo dos veces con 10 mililitros de medio, vertiendo el lavado a través del filtro cada vez también. Centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 500 veces GE y temperatura ambiente. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de medio.

A continuación, agregue cinco mililitros de solución separadora de bio call en un tubo de 15 mililitros y luego coloque cuidadosamente cinco mililitros de suspensión celular encima. Luego, después de centrifugar la solución en capas, los glóbulos rojos se sedimentarán hasta el fondo, mientras que las células madre PBMC y mesenquimales permanecerán en la interfaz. Transfiera las células en la interfaz a un tubo cónico de 15 mililitros y use cinco mililitros de PBS para lavar las células madre mesenquimales y PBMC recolectadas dos o tres veces.

Luego gire las células una vez más y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio. Finalmente, cuente las células con un hemocitómetro y luego póngalas en una placa a una densidad de siembra inicial de aproximadamente cinco veces 10 a la sexta en platos de 150 milímetros. Después de dos o tres días, mantenga los cultivos eliminando las células no adherentes.

Enjuagar la placa con PBS para eliminar los restos celulares y alimentar las células con medio fresco y completo el día de la implantación. Comience exponiendo las células adherentes al 0,25% de tripsina EDTA durante tres minutos. Detenga la tripsinización mediante la adición de medio completo.

A continuación, transfiera las células madre mesenquimales desprendidas a un tubo cónico de 50 mililitros y lávelas dos veces con PBS. Después de determinar el recuento de células y la viabilidad mediante tinción con azul de triano, prepare una mezcla maestra de al menos un coágulo más según sea necesario para que n sea igual a cuatro. Haga girar 200.000 células en un tubo de microcentrífuga y luego vuelva a suspender el pellet en 68 microlitros de PBS y 100 microlitros del componente fibrinógeno de un kit de carbón tisú.

A continuación, inocule cuatro microlitros de solución de trombina en un orificio de una placa estéril preperforada. Agregue inmediatamente los 42 microlitros de una suspensión celular de fibrinógeno y luego cubra la suspensión celular con cuatro microlitros más de solución de trombina. Inicialmente, el volumen de 50 microlitros de la suspensión de celdas de fibrinógeno pipeteado, sobresaldremos sobre el borde del orificio preperforado debido a la tensión superficial.

Sin embargo, después de una hora, la mezcla estará completamente coagulada y se habrá contraído para encajar en el orificio preperforado. Ahora, use pinzas romas para quitar cuidadosamente el coágulo y luego colóquelo en un tubo de microcentrífuga que contenga PBS. Después de desinfectar la rodilla afeitada, palpe bien la rótula y realice una incisión cutánea medial a la rótula.

A continuación, abra la articulación de la rodilla mediante una artrotomía medial en condiciones estériles y, a continuación, desplace la rótula lateralmente. Ahora use un taladro eléctrico de aire estéril con una broca de 3,6 milímetros de diámetro y un dispositivo de tope para crear dos defectos osteocondrales en forma de ocho de tres milímetros de profundidad en el surco de la tróclea. Luego, después de enjuagar los defectos con solución salina estéril, dispense 20 microlitros de pegamento de fibrina de manera uniforme en el fondo de los defectos rápidamente antes de que el pegamento se seque.

Implante los coágulos ajustados a la prensa en el defecto en forma de ocho croma. Después de la coagulación, reubique la rótula dentro del surco troclear y doble y estire la rodilla varias veces. A continuación, vuelva a desplazar la rótula lateralmente y compruebe si los coágulos de células de fibrinógeno siguen en su lugar.

Después de reemplazar la rótula nuevamente, cierre la herida en capas con cuatro suturas Monocryl de un solo botón y una continua Monocryl cutánea de cuatro aut. Por último, selle la herida con un apósito en spray permeable al vapor de agua. En este experimento, el defecto se rellenó con tejido de reparación con propiedades biomecánicas similares y durabilidad similares a las del cartílago circundante.

Este coágulo de células de fibrina se preparó in vitro en una placa estéril con orificios preperforados, que tenía el mismo tamaño que el defecto osteocondral. Como resultado, no había hendiduras entre el coágulo de fibrina implantado y el cartílago circundante, lo que sería un factor de riesgo de degeneración prematura o delaminación. Se aseguró un desgarro basal del tejido de reparación porque se penetró el hueso subcondral y, por lo tanto, se trabajó contra el cizallamiento.

Otro aspecto importante fue la rigidez del tejido de reparación, que debe coincidir con el tejido cartilaginoso sano circundante para evitar un aumento de la carga sobre la articulación y una posible degeneración prematura. Además, se encontró una superficie intacta y homogénea del trasplante, lo que redujo el estrés y el posible daño del implante después de su desarrollo. Esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de la investigación con células madre ortopédicas exploren opciones de tratamiento para los defectos osteocondrales y un modelo animal experimental.

Para una demostración más explícita de algunas de las técnicas de preparación animal y cirugía de rodilla, asegúrese de ver nuestro artículo complementario de Jovi Trasplante de condrocitos autólogos asistido por matriz para la remodelación y reparación de defectos condrales. En un modelo de conejo.