칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리 ^{2 +} 과도하고 막 전류

이 절차의 전반적인 목표는 칼슘, 과도 전류 및 막 전류의 동시 측정에 적합한 인간 심방 근세포를 분리하는 것입니다. 심장 절개 수술을 받는 환자로부터 우심방 표본을 채취하여 신속하게 이송하여 절차를 시작합니다. 절차의 첫 번째 단계는 조직을 청소하고 작은 조직 덩어리로 자르는 것입니다.

두 번째 단계는 단백질 분해 효소를 사용하여 조직을 이중으로 효소 분해하여 고립된 심방 근세포를 생성하는 것입니다. 마지막 단계는 칼슘에 민감한 형광 염료로 근세포를 로딩하는 것으로 구성됩니다. 궁극적으로, epi 형광 현미경 검사와 패치 클램프 기술의 결합은 막 전류 또는 활동 전위와 함께 칼슘 과도 현상을 동시에 기록합니다.

이 방법은 심방세동과 같은 심장 질환의 기저에 있는 세포 칼슘 처리 이상의 분자 기초를 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 본 실험실의 선임 기술자인 Claudia Lira가 관상동맥 우회술 또는 승모판 치환술을 위해 심장 절개 수술을 받은 환자로부터 얻은 인간 심방 조직을 운반 솔루션으로 실험실로 신속하게 운송해야 함을 입증합니다. 실험실에 도착하면 조직 샘플과 용액을 10cm 접시에 옮깁니다. 그런 다음 가위를 사용하여 지방 조직을 대충 제거합니다.

다음으로 조직 샘플을 흔듭니다. 세포 분리를 위해 200에서 600mg 사이를 유지하고 나머지는 생화학 분석을 위해 액체 질소에 동결합니다. 세포 분리를 위한 조직을 시원한 칼슘이 없는 용액 접시에 옮기고 조직을 1입방 밀리미터 덩어리로 잘라 조직을 씻습니다.

칼슘이 없는 용액과 함께 재킷 비커로 옮깁니다. 37도까지 가열합니다. 강한 거품을 방지하기 위해 피펫 팁으로 덮인 라인에서 산소를 공급하십시오.

마그네틱 교반 막대로 약 3분 동안 조직을 조심스럽게 저어줍니다. 그런 다음 조직이 가라앉도록 합니다. 이제 200 미크론 나일론 메쉬를 통해 상등액을 조심스럽게 걸러냅니다.

대부분의 조직은 비커에 남아 있어야 합니다. 비커에 데운 37도 칼슘이 없는 용액을 다시 채웁니다. 그런 다음 집게를 사용하여 메쉬에서 변형된 조직 덩어리를 비커로 되돌리고 세척 절차를 두 번 반복합니다.

콜라겐 분해 효소 용액 E를 함유 한 섭씨 37도 예열 된 효소 용액 E 20 밀리리터를 준비하여 절차의이 부분을 시작하십시오. 최종 세척 단계 후에 칼슘이 없는 용액을 조심스럽게 걸러내고 세척된 조직을 E 용액에 다시 현탁시킵니다. 메쉬에 모인 조직을 비커로 되돌립니다.

현탁액을 10분 동안 조심스럽게 저어줍니다. 그런 다음 40마이크로리터의 10밀리몰 염화칼슘을 넣고 35분 동안 계속 저어줍니다. 다음으로, 나일론 메쉬를 통해 상층액을 조심스럽게 걸러냅니다.

대부분의 조직은 비커에 남아 있어야 합니다. 콜라겐 분해 효소 1 개만을 함유 한 20 밀리리터의 효소 용액 E 2를 준비하고 비커를 다시 채우는 데 사용합니다. 메쉬에 모인 조직을 비커로 되돌립니다.

그런 다음 두 번째 소화 중에 즉시 40 미크론의 10 밀리 몰라 염화칼슘 용액을 추가하고 때때로 가위를 사용하여 조직 혈전을 잘게 자릅니다. 5분 후, 현탁액 샘플을 채취하여 현미경으로 세포의 해리를 확인합니다. 막대 모양의 줄무늬 심근세포가 명확하게 보일 때까지 2-3분마다 샘플을 계속 채취합니다.

그런 다음 교반을 멈추고 조직이 가라앉도록 합니다. 일단 정착되면 나일론 메쉬를 통해 플라스틱 50 밀리리터 튜브에 상등액을 조심스럽게 걸러냅니다. 다음으로, 조직을 20ml 저장 용액에 매달아 놓고 메쉬에서 비커로 변형된 조직 덩어리를 되돌립니다.

부드러운 기계적 tation에 의해 세포를 추가로 해리합니다. 20 밀리리터 피펫으로 기포 형성을 피하십시오. 다음으로, 변형 원심분리기 후 나일론 메쉬를 통해 상층액을 조심스럽게 걸러내고, 두 상층액 모두 90 5G에서 10분 동안 수집합니다.

세포를 펠릿화하려면 펠릿 소련을 방해하지 않고 흡인으로 상등액을 버리십시오. 각 펠릿을 실온에서 1.5ml의 저장 용액에 현탁시킵니다. 그런 다음 각 튜브에 7.5마이크로리터의 10밀리몰 염화칼슘 용액을 넣고 10분 동안 기다립니다.

그런 다음 7.5마이크로리터의 염화칼슘을 더 넣고 10분 더 기다립니다. 기다린 후 세 번째 15마이크로리터 부피의 10밀리몰 염화칼슘을 추가하여 용액 내 염화칼슘의 최종 농도를 0.2밀리몰로 만듭니다. 이 분리의 목적은 세포 내 칼슘 측정에 적합한 세포를 얻는 것입니다.

따라서 저장 용액에서 EGGA와 같은 칼슘 완충액을 생략하는 것이 중요한 요구 사항입니다. 1.5ml의 세포 현탁액을 2mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 단계는 형광 칼슘 지시약의 광 감도를 고려하여 수행해야 합니다.

독감 O 3. 먼저, 1 밀리 몰 독감 오 3 : 00 AM 재고 용액을 만듭니다. 이 용액은 최대 1주일 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

다음으로, 15ml의 독감 오 3:00 AM 원료 용액을 1.5ml 세포 현탁액에 추가합니다. 혼합물을 조심스럽게 교반하고 불투명한 상자에 넣어 실온에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 외피 후에, 대략 6, 000 분당 회전수에 조직을 짧게 분리기

그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 1.5 밀리리터의 수조 용액에 다시 현탁시킵니다. 실험을 시작하기 전에 d 에스테르화를 위해 약 30분 동안 세포 현탁액을 그대로 두십시오. 그런 다음 설명된 프로토콜을 사용하여 동시 패치 클램프 및 epi 형광 칼슘 측정을 진행합니다.

근세포는 심방 조직에서 분리되어 세포 파인더 현미경 슬라이드에서 정량화되었습니다. 평균 세포 수율은 만성 심방세동 환자의 샘플에서 세포 수율을 낮추는 경향이 있음을 분명히 나타냅니다. 독감 오 3 개의 적재 된 근세포는 활동 전위를 유도하기 위해 전류 클램프 구성에서 0.5 헤르츠로 자극되었으며, 조사 된 세포의 약 90 %가 규칙적인 수축을 보였다.

이러한 자극에 대한 반응으로, 형광 현미경 검사법으로의 전환은 세포 수축을 시작하는 근경 소포체에서 칼슘 방출을 유발하는 활동 전위를 시각화합니다. 부비동 리듬과 심방세동이 있는 환자의 대표적인 기록은 sr. 환자 활동 전위는 일반적으로 스파이크와 돔 모양을 갖는 반면, 활동 전위 삼각 측량 및 단축은 심방 리모델링의 전형적인 특징입니다.

심방세동에서 환자는 동시에 세포 내 칼슘 과도 현상을 기록했고, 심방세동 환자의 근세포에서 이완기 칼슘 수치가 증가하고 칼슘 과도 진폭이 감소하여 L형 칼슘 전류를 기록했습니다. 칼륨 전류는 4개의 아미노 파리딘과 염화바륨을 사용하여 차단되었습니다. 셀은 마이너스 80 밀리 볼트의 유지 전위를 사용하여 0.5 헤르츠에서 마이너스 40 밀리 볼트까지의 램프와 100 밀리 초 테스트 펄스에서 10 밀리 볼트를 사용하여 전압 클램프 구성에서 0.5 헤르츠로 자극되었습니다.

대표적인 기록에 따르면 심방세동은 감소된 L형 칼슘 전류와 관련이 있습니다. 다시 말하지만, 이완기 칼슘 수치는 증가한 반면, 칼슘 과도 진폭은 더 낮았습니다. 심방세동에서.

비선택성 베타 부신 수용체 작용제 이소프렌의 적용은 L 형 칼슘 전류 및 세포질 칼슘 과도 상태의 진폭을 증가시켰다. 두 그룹 모두에서 이는 세포가 온전한 베타 아드레날린 신호 전달 캐스케이드를 가지고 있음을 시사합니다. 결과는 이 방법이 패치 클램프 및 칼슘 과도 측정을 동시에 수행하는 데 적합한 고품질 칼슘 내성 근세포를 제공한다는 것을 보여줍니다.

또한, 얻어진 근세포는 세포 단축 측정, 면역 염색 또는 TTU 염색에 유용할 수 있습니다.