Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

שימוש בהמסיטומימטר לספירת תאים
 
Click here for the English version

שימוש בהמסיטומימטר לספירת תאים

Overview

ניסויים ביו-רפואיים רבים דורשים מניפולציה של כמות ידועה של תאים, על מנת להשיג נתונים מדויקים, ניתנים לשחזור ורלוונטיים סטטיסטית. לכן, לימוד כיצד לספור תאים היא טכניקה חיונית במיוחד עבור כל מדען ביו-רפואי מוצלח. הדרך הנפוצה ביותר לספור תאים היא באמצעות hemacytometer - מכשיר הנושא שתי רשתות חרוט לייזר, אשר מסייעים בספירה של תאי aliquot תחת מיקרוסקופ אור פשוט. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להסיק את מספר התאים במדגם ניסיוני.

וידאו זה יראה כיצד: להתאים את ריכוז המדגם הניסיוני כך שאתה לא מנסה לספור יותר מדי - או מעט מדי - תאים; כיצד להשתמש hemacytometer לספור aliquot קטן (~ 10 μl) של תאים; כיצד לקבוע באיזה רבע של רשת הלייזר hemacytometer להשתמש לספירה; כיצד לחשב את המספר הכולל של תאים במדגם הניסיוני שלך, בהתאם לרביע בו נעשה שימוש; וכיצד לקבוע את הכדאיות של אוכלוסיית התאים הניסיוניים שלך באמצעות הדרה כחולה טריפאן. יתר על כן, נדונים גם מצבים ניסיוניים שונים שבהם יש צורך בהגדרה אמינה ומדויקת של מספרי תאים, כולל דוגמה באמצעות מונה תאים אוטומטי.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ספירת תאים היא צעד חשוב במבחנים רבים המבוססים על תאים לקביעת מספר התא והישימות. באופן כללי, מטרת הספירה היא להבין עד כמה יש לדלל מדגם של ריכוז תאים לא ידוע לשימוש נוסף. כלי המעבדה הנפוץ ביותר לספירת תאים הוא המציטומימטר.

המציטומטר הוא כלי ספירה שנוצר במקור לספירת תאי דם. במרכז המסטיקומטר נמצאים שני תאי ספירה, שעליהם ניתן למצוא רשת חרוטים בלייזר.

הרשת מורכבת מ-9 רבעים עיקריים. ארבעת הרבעים הפינתיים מחולקים עוד יותר ל-16 רבעים קטנים יותר. הרביע המרכזי מחולק ל-25 מהרביעים הקטנים הללו, שכל אחד מהם מחולק עוד יותר ל-16 מיקרו-רבעים.

בקצה הרחוק של כל תא נמצאות יציאות מבוא לדוגמה, שלתוך כך מחולקת דגימת התא שיש לספור.

משני צדי תאי הספירה נמצאים תומכי הרכבה של החלקת הכיסוי, שעליהם מונח הקוורץ, בדרך כלל כ-0.1 מ"מ מעל תא הספירה.

מאז השטח של כל ריבוע גדול הוא 1 mm2, הנפח הכלול על ידי כל ריבוע גדול הוא 0.1 mm3 או 1/10,000th של מיליליטר.

לפני הספירה, תמיד לקחת רגע להשתמש אתנול קימאוויפה כדי לנקות ולייבש את כל מוך, טביעות אצבעות, או סימני מים מן כיסוי ואת תא הספירה.

לאחר מכן להוסיף בזהירות כמות קטנה של מים לכל אחד תומכי הרכבה כיסוי, מתח פני השטח של המים יחזיק את כיסוי במקום.

עכשיו בעדינות טריטרציה מתלה התא, או pipette אותו למעלה ולמטה, כדי לסלק כל גושי תא. השתמש micropipette לשאוף כ 10 μl של ההשעיה ולאחר מכן לטעון אחת מנמלי המבוא עם המדגם. הפתרון יימשך לתוך תא הספירה על ידי פעולה נימית וצריך לכסות את הרשת כולה.

בזמן שהתאים מתיישבים, בחר את המטרה. ואז לטעון את hemacytometer על הבמה.

התצוגה הבאה של התאים מתחת למיקרוסקופ. אם יש פחות מ -5 תאים בכל אחד מהרביעים הגדולים, ייתכן שיהיה עליך לסובב את המדגם שלך למטה שוב ולתתב מחדש את הכדור בנפח קטן יותר. אם התאים חופפים זה לזה או שהם פשוט צפופים מכדי להבחין בקלות זה מזה, ייתכן שיהיה עליך לדלל את המדגם בנפח גבוה יותר של פתרון. הקפד לעקוב אחר הגורם שבו אתה מדלל את התאים שלך. תזדקק לו בחישוב מאוחר יותר.

עכשיו הגיע הזמן לספור את התאים!

כפי שדיברנו קודם לכן, תא הספירה מכוסה ברשת חריטה בלייזר. הקווים של הרבעים מקלים על המעקב אחר התאים שאתה סופר. בחר את רבע הגודל לספירה בהתאם לצפיפות התאים במדגם שלך. לדוגמה, אם קיים מספר נמוך של תאים, ספר את כל התאים באחד מהרביעים הפינתיים. עבור דגימות עם כמות בינונית של תאים, בחר אחד מ- 16 הרביעים הקטנים יותר. אם יש צפיפות גבוהה מאוד של תאים, לספור את התאים באחד 25 הרבעים המרכזיים. לא משנה איזה רבע תבחר או את הצפיפות של דגימת התא, לספור לפחות 20-50 תאים לכל התלבטות.

לא כל התאים ייפלו בצורה מסודרת בתוך הרביעים. ניתן לספור את התאים שנוגעים בקווים העליונים והשמאליים, אך להתעלם מאלה שנוגעים בקו התחתון או הימני. כדי לקבל את הספירה המדויקת ביותר, השתמש במונה תאים כדי לעקוב אחר התאים ולקחת את הממוצע של מספר התאים בארבעה רבעים באותו גודל.

כדי לחשב את מספר התאים בנפח של 1 מ"ל, הכפל את מספר התאים שנספרו ב- 10,000, מכיוון שכאמור, כל ריבוע גדול ברשת הוא 1/10,000th של מיליליטר. אם ספרתם אחד מהרביעים הגדולים האלה, פשוט הכפילו את המספר הזה 1. אם ספרתם את אחד הריבועים הקטנים יותר באחד מהרביעים הפינתיים, הכפלו את המספר הזה ב- 16. אם ספרתם את כל התאים באחד מ-25 הרבעים המרכזיים, הכפלו את המספר הזה ב-25. אם במקרה לדלל את ההשעיה הסלולרית שלך לפני טעינת hemacyotmeter, תצטרך גם להכפיל על ידי גורם דילול.

לאחר מכן, כדי לחשב את מספר התאים ב- 1 מ"ל של מדגם זה, נכפיל את 20 התאים ברביע המרכזי הזה ב- 104 ו- 25 כדי לקבל סך של 5 x 106 תאים ב- 1 מ"ל של הדגימה.

עכשיו שאנחנו יודעים את המספר הכולל של תאים ב 1 מ"ל של המדגם, אנחנו צריכים להכפיל את המספר הזה על ידי הנפח הכולל של הפתרון שלנו. לדוגמה, אם יש לנו 5 x 106 תאים ב 1 מיליליטר, אז ב 2 מ"ל, יהיה לנו סך של 1 x 107 תאים.

לאחר מכן, כדי למנוע שגיאות מספירה שגויה, הפצה לא אחידה של תאים או שגיאות צנרת, טען את הצד השני של התא וספור את דגימת התא שלך בפעם השנייה.

ספירת התאים מתחת למיקרוסקופ היא גם זמן נהדר להעריך את הכדאיות של התאים במדגם שלך. כחול טריפן, כתם חיוני, מעורבב לעתים קרובות עם המדגם לפני שהוא נטען לתוך hemacytometer למטרה זו.

תאים חיים אינם כוללים את הצבע הזה, כי תאים חיים הם מאוד סלקטיביים לגבי מה שהם מאפשרים דרך הממברנות שלהם. תא מת, לעומת זאת, אין קרום שלם, אשר מאפשר את כחול טריפן לעבור ולהכתים את הציטופלסמה.

כדי לבדוק את הכדאיות של דגימת התא שלך, לדלל aliquot של השעיית התא שלך בכחול טריפן, ולאחר מכן לטעון את מדגם המוכתם כחול טריפן בדיוק כמו מדגם התא הרגיל. תחת ניגודיות הפאזה, התאים החיים יופיעו בהירים וזהובים ויש לספורם; אל תספור אף אחד מהתאים הכחולים המשעממים, המתים.

חשב את מספר התאים כבעבר, והפעם הכפלת המספר הסופי בגורם הדילול הכחול של טריפאן. אז אם המדגם הייצוגי המקורי שלנו היה מדולל תחילה בכחול טריפן, היינו מכפילו את המספר הכולל של התאים שלנו על ידי דילול כחול טריפן 1:10 שלנו,

כשתסיים לספור, זכור לנקות את כיסוי ואת תא הספירה!

עכשיו שאתם מקצוענים בספירת תאים, בואו נדבר על כמה מהסיבות שאולי תצטרכו לדעת כמה תאים יש לכם בניסוי מסוים.

לאחר בידוד תאים מרקמה רגילה או ניסיונית, חשוב לדעת כמה תאים התאוששת. כאן החוקרים ירצו לדעת כמה טחול, או תאי טחול, הם בודדו מטחול העכבר הזה.

כאשר אתם מבצעים ניסוי כדי לראות כיצד שתי אוכלוסיות תאים שונות מגיבות, חשוב לדעת כמה מכל סוג תא אתם מערבבים יחד, כמו בניסוי תרבית משותפת זה עם תאי B ו- T.

אתה רוצה לדעת כמה תאים יש לך עבור סוגים רבים אחרים של התקפות מבוססות תא. כאן בדיקת ELISPOT מוגדרת כדי לקבוע את מספר התאים במדגם כי יהיה להפריש IFNγ, חלבון דלקתי, בתגובה לנגיף הפפילומה האנושי.

בעת ביצוע ניסוי שבו mRNA צריך להיות מופק, או מבודד, מתאי העניין שלך, חשוב לדעת כמה שיחות אתה מתחיל עם, על מנת להשיג כמות מספקת של mRNA לניסוי.

המציטומימטר הוא כלי זול וקל יחסית לשימוש לספירת תאים, אך הוא יכול להיות מייגע ויש לו פוטנציאל לטעות אנוש.

המונה האוטומטי של שרביט כף היד הוא, כפי שהשם מרמז, התקן ספירה ידני בעל דיוק ספירה משופר בהשוואה להמציטומימטר ויכול להפלות הן את הגודל והן את עוצמת הקול של התאים בדגימת תא.

מונה התאים האוטומטי TC10 מעריך הן את מספר התא והן את הכדאיות, מחשב באופן אוטומטי את מספר התא הכולל במדגם שלך ומאפשר להציג את התאים גם במסך הקריאה שלו.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לספירת תאים. בסרטון זה סקרנו: מהו hemacytometer, כיצד לספור תאים ולקבוע את הכדאיות התא, וכמה סיבות שונות ייתכן שיהיה עליך לספור תאים. תודה שצפיתם וזכרו לא לספור את התאים הכחולים!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter