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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Separação de proteínas com SDS-PAGE

Overview

Sulfato de sulfato de sódio Poli-Acrilamida Gel Electrophoresis, ou SDS-PAGE, é uma técnica amplamente utilizada para separar misturas de proteínas com base em seu tamanho e nada mais. SDS, um detergente aniônico, é usado para produzir uma carga uniforme em todo o comprimento das proteínas que foram linearizadas. Primeiro carregando-os em um gel feito de poliacrilamida e, em seguida, aplicando um campo elétrico ao gel, as proteínas revestidas de SDS são então separadas. O campo elétrico atua como a força motriz, atraindo proteínas revestidas de SDS em direção ao ânodo com proteínas maiores movendo-se mais lentamente do que pequenas proteínas. Para identificar proteínas por tamanho, padrões proteicos de tamanho conhecido são carregados junto com amostras e executados sob as mesmas condições.

Este vídeo apresenta uma introdução ao SDS-PAGE explicando primeiro a teoria por trás dele e, posteriormente, demonstrando seu procedimento passo-a-passo. Vários parâmetros experimentais, como a concentração de poliacrilamida e a tensão aplicada ao gel são discutidos. Métodos de coloração a jusante como Coomassie e manchas de prata são introduzidos, e variações do método, como a eletroforese de gel 2D são apresentadas.

Procedure

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O SDS-PAGE é uma técnica usada por muitos pesquisadores para separar misturas de proteínas por tamanho. A conclusão bem sucedida dessa técnica é um primeiro passo essencial para muitos métodos de análise de proteínas, como a imunoblotação. Por si só, é uma ferramenta útil na avaliação do tamanho da proteína e da pureza.

Para entender a técnica SDS-PAGE, você deve primeiro entender seus componentes-princípio. SDS-PAGE significa Sulfato de Sódio Poli-Acrilamida Gel Electrophoresis. Sulfato de sódio-dodecyl, a primeira parte disso, ou "SDS", é um detergente aniônico. Isso significa que ele é composto por um grupo hidrofílico com uma carga negativa líquida e uma longa cadeia hidrofóbica com carga neutra.

A cadeia hidrofóbica cobre proteínas em proporção à sua massa a uma taxa de 1,4 gramas de SDS por grama de proteína. Isso fornece às proteínas a força motriz necessária para a separação orientada pelo tamanho em um campo elétrico.

Poli-Acrilamida Gel Electrophoresis utiliza um hidrogel feito de poliacrilamida. Poliacrilamida é um polímero que forma uma matriz muito regular através da qual as proteínas podem se mover. Quanto mais concentrado o gel estiver, mais lentas as proteínas atravessarão quando expostas a um campo elétrico. O processo de usar um campo elétrico espacialmente uniforme para influenciar um movimento de objetos é conhecido como eletroforese.

O SDS-PAGE é realizado em proteínas isoladas de muitas fontes diferentes, incluindo células na cultura, tecidos, sangue, urina e levedura.

As proteínas dessas diversas fontes devem primeiro ser separadas de outros componentes celulares usando técnicas como homogeneização e centrifugação, muitas vezes seguidas pelo uso de tampões de lise.

Uma vez que a proteína é isolada, sua concentração é frequentemente medida, para garantir o carregamento igual das amostras, comparando a quantidade de proteína na amostra aos padrões de albumina em um ácido bicinchonínico, ou BCA, assiiz assimétrico.

Um passo importante a ser lembrado é a adição do buffer de carregamento. O buffer de carregamento tem 3 funções principais. Primeiro, graças às SDS e agentes redutores adicionais, ela desnatura as proteínas, o que basicamente significa que transforma estruturas proteicas complexas em uma cadeia linear de aminoácidos. Em segundo lugar, contém glicerina, que garante que a amostra não flutue para longe quando estiver carregada nos poços do gel. E, finalmente, a maioria dos buffers de carregamento comerciais incluem um corante, como o azul bromofenol, que pode ser rastreado para medir o progresso da etapa de eletroforese.

Depois de adicionar o tampão de carga, as amostras precisam ser misturadas e depois fervidas por 5 minutos. Isso permite que as fortes ligações di-sulfeto nas proteínas sejam quebradas com a ajuda de um agente redutor como o beta-mercaptoetanol. Uma vez que todas as ligações de dissulfeto são quebradas SDS pode mais uniformemente revestir as proteínas.

Em seguida, as amostras são rapidamente giradas para baixo e, em seguida, estão prontas para serem carregadas no sistema de gel para eletroforese.

Antes que as amostras possam ser carregadas, o sistema de gel deve primeiro ser montado. Isso começa com a compra ou fabricação de um gel de poliacrilamida. Géis pré-fabricados estão se tornando cada vez mais populares porque a acrilimida é neurotóxica e pode causar danos cerebrais. O de gel contém poços que são usados para carregar as amostras.

Uma vez que os géis são fixados no lugar, as câmaras internas e externas são preenchidas com um tampão que contém a mesma concentração de íons usados para fazer os géis. Isso cria um circuito elétrico que passa perfeitamente do cátodo, através do gel e para o ânodo.

Em seguida, escadas de peso molecular são tipicamente carregadas no gel, seguidas pelas amostras. À medida que o gel corre, a escada se espalhará e criará faixas de proteínas visíveis de tamanhos conhecidos. Nos passos finais, essas bandas podem ser usadas para calcular o tamanho de cada proteína.

Uma vez que todas as amostras são carregadas, os terminais positivos e negativos na caixa de gel são conectados a uma fonte de energia capaz de manter uma tensão constante por um longo período de tempo. Os géis são tipicamente iniciados em torno de 60V até que toda a amostra tenha entrado na região do gel chamada "gel de empilhamento". Em seguida, a tensão é aumentada para cerca de 200V por 30 minutos a 1 hora, dependendo do tamanho e concentração do gel e do tamanho da proteína de interesse.

Quando a eletroforese estiver completa, o é removido e aberto para expor o gel. O gel pode então ser manchado com uma mancha de proteína típica, como a mancha azul coomassie ou prata, para visualizar as faixas proteicas dentro do gel. A mancha de coomassie pode detectar bandas com apenas 50 nanogramas de proteína, enquanto a mancha de prata pode detectar faixas com apenas 1 nanograma de proteína.

Em eletroforese de gel bidimensional, as amostras são separadas por duas propriedades separadas em géis, uma dimensão de cada vez. Primeiro, as amostras são carregadas e organizadas de acordo com seus pontos isoelétricos em tiras de gradiente de pH localizadas. As proteínas na tira são então desnaturadas e são colocadas em cima de um gel típico de poliacrilamida onde são fixadas no lugar com solução de gel fresco. Em seguida, a separação da segunda dimensão é realizada por SDS-PAGE.

Embora o foco isoelétrico não seja a única opção para eletroforese de gel 2D, é o mais comum. A eletroforese de gel bidimensional é uma ferramenta inestimável que fornece insights sobre complexos proteicos e organização sub-organela.

Depois de executar o gel, um próximo passo muito comum é transferir as proteínas do gel para uma membrana feita de PVDF ou nylon para análise. Você pode então usar anticorpos específicos para sondar a membrana e procurar proteínas de interesse. Aqui são mostrados resultados típicos de imunoblot onde o pesquisador usou 3 diferentes técnicas de amplificação de sinal para determinar qual melhor mostra a presença da proteína Pit-1 ao longo de uma série de diluições seriais.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre separação de proteínas usando SDS-PAGE. Agora você deve entender os passos envolvidos na resolução de uma proteína por tamanho usando esta técnica poderosa. Como sempre, obrigado por assistir!

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