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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Introduzione a Saccharomyces cerevisiae

Overview

Saccharomyces cerevisiae (comunemente noto come lievito di birra) è un eucariota unicellulare che viene frequentemente utilizzato nella ricerca scientifica. S. cerevisiae è un organismo modello attraente per il fatto che il suo genoma è stato sequenziato, la sua genetica è facilmente manipolabile ed è molto facile da mantenere in laboratorio. Poiché molte proteine del lievito sono simili in sequenza e funzione a quelle che si trovano in altri organismi, gli studi condotti sul lievito possono aiutarci a determinare come funziona un particolare gene o proteina negli eucarioti superiori (compresi gli esseri umani).

Questo video fornisce un'introduzione alla biologia di questo organismo modello, come è stato scoperto e perché i laboratori di tutto il mondo lo hanno selezionato come modello di scelta. Vengono anche discussi studi precedenti condotti in S. cerevisiae che hanno contribuito alla nostra comprensione di importanti processi cellulari come il ciclo cellulare, l'invecchiamento e la morte cellulare. Infine, il video descrive alcuni dei molti modi in cui le cellule di lievito vengono messe al lavoro nella moderna ricerca scientifica, tra cui la purificazione delle proteine e lo studio dei meccanismi di riparazione del DNA e di altri processi cellulari legati alle malattie di Alzheimer e Parkinson.

Procedure

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Saccharomyces cerevisiae,altrimenti noto come lievito di birra, è uno dei tanti organismi modello studiati nei laboratori di tutto il mondo. Poiché il suo genoma è stato sequenziato, la sua genetica è facilmente manipolabile ed è facile da mantenere in laboratorio, questa specie di lievito è stata una risorsa inestimabile nella comprensione dei processi cellulari fondamentali come la divisione cellulare e la morte cellulare. Questo video ti darà una panoramica di questo organismo modello e della sua vasta gamma di applicazioni nella ricerca biologica e biomedica.

Il lievito appartiene al dominio Eukaryota, che è composto da organismi con nuclei legati alla membrana, indicati come eucarioti. Insieme a funghi e muffe, S. cerevisiae appartiene al Regno Funghi per la presenza di una parete cellulare fatta di chitina, un polimero polisaccaride che si trova non solo nei funghi, ma anche negli esoscheletri di insetti e crostacei.

È interessante notare che molte proteine presenti nel lievito condividono sequenze simili con le proteine dei loro compagni eucarioti. Queste proteine sono spesso omologhe e le loro sequenze simili indicano che gli organismi condividono un antenato comune. Studiando la funzione di una determinata proteina nel lievito, i ricercatori ottengono informazioni sulla funzione della proteina negli eucarioti superiori, come noi, gli esseri umani.

In natura, S. cerevisiae si trova in ambienti caldi e umidi, con una fonte di zucchero a portata di mano. Uno dei suoi luoghi di ritrovo preferiti è il vigneto, dove si sofferma sulla buccia dell'uva.

S. cerevisiae ha una forma ovoidale da rotonda a ellissoidale ed è tipicamente di 5-10 micrometri di diametro se visualizzato utilizzando un microscopio a campo luminoso.

Quando la maggior parte delle cellule eucariotiche si divide attraverso la mitosi e la citochinesi, c'è un'uguale segregazione del materiale genetico e del citoplasma nelle cellule figlie. D'altra parte, S. cerevisiae subisce la divisione cellulare attraverso un processo chiamato germogliamento.

Questa forma di riproduzione asessuata comporta la formazione di una gemma appena sintetizzata dalla cellula madre, che cresce di dimensioni durante tutto il ciclo cellulare fino alla citochinesi. A differenza della tipica divisione cellulare eucariotica, le due cellule non sono di dimensioni uguali dopo la mitosi.

Ora che abbiamo imparato un po 'di S. cerevisiae come organismo, discutiamo di ciò che lo rende un ottimo sistema modello per la ricerca.

In primo luogo, le cellule di lievito crescono rapidamente e si dividono approssimativamente ogni 90 minuti. In secondo luogo, sono facili da coltivare e richiedono solo una semplice tecnica e strumentazione per la propagazione. In terzo luogo, essendo il primo organismo eucariotico ad avere il suo intero genoma sequenziato, S. cerevisiae ha tutte le sue sequenze geniche pubblicamente disponibili tramite il database del genoma del lievito.

Anche la manipolazione genetica del lievito è estremamente pratica. La maggior parte dei vettori di S. cerevisiae, portatori di una sequenza di DNA di interesse, sono vettori navetta. I vettori shuttle sono solitamente plasmidi che possono propagarsi in due specie diverse, come E. coli e S. cerevisiae. Ciò consente di eseguire la clonazione molecolare in E. coli, ad esempio per incorporare il gene per la proteina fluorescente verde delle meduse in un vettore navetta, che può essere introdotto nel lievito per farli brillare.

Il plasmide integrativo del lievito è un tipo di vettore navetta che consente l'incorporazione di DNA estraneo nel genoma del lievito attraverso un processo chiamato ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa è uno scambio di DNA tra sequenze corrispondenti o simili che si traduce in un crossover genetico tra il vettore e il DNA genomico dell'ospite. Ciò può causare l'uscita di un gene o lo scambio di un gene con un altro. Inoltre, poiché la ricombinazione omologa provoca l'integrazione nel genoma dell'ospite, il cambiamento genetico persiste dopo che la cellula di lievito si divide.

Ora che sai cosa rende il lievito così conveniente per lo studio, diamo un'occhiata al motivo per cui queste piccole creature sono state così importanti scientificamente. Molto, molto tempo fa, all'inizio del 6 ° millennio B.C., il lievito era coinvolto nella fermentazione delle uve per fare vino. Il lievito in seguito ha avuto un ruolo nella cottura del pane nell'antico Egitto.

Fu solo nel 1856 che Luis Pasteur identificò S. cerevisiae come il microbo chiave per la vinificazione e la cottura del pane. Ha classificato il lievito come un anaerobe facoltativo, che, in assenza di ossigeno, passa alla fermentazione, un processo che consente al lievito di metabolizzare gli zuccheri e produce alcol come sottoprodotto. In questo processo, il piruvato, prodotto dalla glicolisi, viene ridotto ad acetilaldeide, che viene poi, grazie alla conversione del NADH in NAD+, ridotto a etanolo, l'ingrediente determinante nel vino.

Saltando avanti al 20 ° secolo, la scoperta delle proteine che regolano il ciclo cellulare è stata trovata nel lievito da Hartwell e Nurse.

Il ciclo cellulare è una serie di eventi cellulari che include la corretta replicazione e segregazione del DNA nucleare prima che una cellula si divida. L'identificazione della proteina ciclina e della chinasi ciclina-dipendente, insieme al cambiamento della loro abbondanza relativa attraverso l'interfase e la mitosi, ha suggerito che queste proteine sono regolatori chiave della divisione cellulare. La natura altamente conservata di queste proteine rende il loro studio nel lievito prezioso per comprendere il ruolo delle chinasi ciclina-dipendenti negli organismi multicellulari, come la disregolazione del ciclo cellulare, che può portare alla divisione cellulare incontrollata, o al cancro.

Avanzando fino a 15 anni dopo, Blackburn, Greider e Szostak fecero studi rivoluzionari nella comprensione dei telomeri e nella scoperta delle telomerasi. I telomeri sono sequenze ripetitive di DNA alla fine di un cromosoma che impediscono al DNA genomico di degenerare. L'aggiunta di queste sequenze ripetitive viene effettuata dalle telomerasi all'estremità 3' fiancheggiante del cromosoma, e la complementazione dei nucleotidi è seguita dalla DNA polimerasi nel filamento in ritardo. I telomeri hanno implicazioni nell'invecchiamento poiché questi segmenti di DNA si accorciano per tutta la vita di un organismo.

Ancora più recentemente, nel 1992, Ohsumi e i suoi colleghi hanno scoperto geni che regolano l'autofagia, una sorta di riciclaggio cellulare. Durante la fame di nutrienti, gli organelli sacrificabili vengono inghiottiti da un autofagosoma. L'autofagosoma si fonderà quindi con un lisosoma, al fine di scomporre ulteriormente le proteine organellari in amminoacidi essenziali per la produzione di nuove proteine. L'autofagia è coinvolta negli importanti meccanismi cellulari che proteggono dagli agenti patogeni invasori e dalla crescita del tumore.

Ci sono una vasta gamma di applicazioni per lo studio del lievito. Il lievito può, ad esempio, essere utilizzato per studiare la mitofagia, che è la rimozione dei mitocondri danneggiati dagli autofagosomi. Questo processo ha implicazioni in malattie come l'Alzheimer e il Parkinson. In questo video, l'autofagia è indotta nelle cellule di lievito con l'aggiunta di mezzo di fame di azoto. Successivamente, le cellule vengono preparate per la microscopia a fluorescenza, al fine di osservare la mitofagia nelle cellule affamate di azoto.

S. cerevisiae è usato per esprimere e purificare grandi quantità di proteine, ad esempio la proteina regolante la conduttanza transmembrana della fibrosi cistica. In questo video, le cellule di lievito che trasportano il plasmide CFTR vengono coltivate in grandi colture. Successivamente, viene eseguita la centrifugazione delle cellule per separare i microsomi. I microsomi sono vasi artefatti formati dal reticolo endoplasmatico quando le cellule vengono interrotte. L'isolamento e la purificazione del CFTR dai microsomi consentiranno agli scienziati di studiare la struttura della proteina utilizzando metodi come la cristallografia a raggi X.

Il lievito può anche essere utilizzato come sistema modello per studi genetici delle proteine di riparazione del DNA umano. Queste proteine rilevano e riparano il DNA danneggiato al fine di prevenire la proliferazione di cellule portatrici di un genoma difettoso, come le cellule tumorali. Qui vedete autori che placcano cellule di lievito con la proteina di riparazione del DNA trasformata, WRN, su piastre di media selettivi. La morfologia cellulare dei mutanti per WRN può essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza e il rilevamento di questa proteina nel lizzata cellulare viene effettuato eseguendo un gel proteico per l'analisi Western Blot.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE a S. cereviae. In questo video abbiamo recensito: la storia, la biologia cellulare e molecolare e le applicazioni biomediche di S. cerevisiae. Speriamo che il nostro video ti sia piaciuto e ti invitiamo a condividerlo con un bocciolo.

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