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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Uma Introdução a Saccharomyces cerevisiae

Overview

Saccharomyces cerevisiae (comumente conhecido como levedura de padeiro) é um eucariote unicelular que é frequentemente usado em pesquisas científicas. S. cerevisiae é um organismo modelo atraente devido ao fato de que seu genoma foi sequenciado, sua genética é facilmente manipulada, e é muito fácil de manter em laboratório. Como muitas proteínas de levedura são semelhantes em sequência e função às encontradas em outros organismos, estudos realizados em leveduras podem nos ajudar a determinar como um gene ou proteína em determinadas funções em eucariotes mais altos (incluindo humanos).

Este vídeo fornece uma introdução à biologia deste organismo modelo, como ele foi descoberto, e por que laboratórios em todo o mundo o selecionaram como seu modelo de escolha. Estudos anteriores realizados em S. cerevisiae que contribuíram para a compreensão de processos celulares importantes, como o ciclo celular, o envelhecimento e a morte celular também são discutidos. Finalmente, o vídeo descreve algumas das muitas maneiras pelas quais as células de levedura são colocadas para trabalhar em pesquisas científicas modernas, incluindo a purificação de proteínas e o estudo de mecanismos de reparação de DNA e outros processos celulares relacionados às doenças de Alzheimer e Parkinson.

Procedure

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Saccharomyces cerevisiae, também conhecido como levedura de padeiro, é um dos muitos organismos modelo estudados em laboratórios em todo o mundo. Por seu genoma ter sido sequenciado, sua genética é facilmente manipulada, e é fácil de manter em laboratório, esta espécie de levedura tem sido um recurso inestimável na compreensão de processos celulares fundamentais, como divisão celular e morte celular. Este vídeo lhe dará uma visão geral deste organismo modelo e sua ampla gama de aplicações em pesquisas biológicas e biomédicas.

A levedura pertence ao domínio Eukaryota, que é composto por organismos com núcleos ligados à membrana, chamados de eucariotes. Junto com cogumelos e moldes, S. cerevisiae pertence aos Fungos do Reino devido à presença de uma parede celular feita de quitina, um polímero de polissacarídeo que é encontrado não só em Fungos, mas também nos exoesqueletos de insetos e crustáceos.

Curiosamente, muitas proteínas encontradas na levedura compartilham sequências semelhantes com proteínas de seus companheiros Eucariotes. Essas proteínas são muitas vezes homólogos, e suas sequências semelhantes indicam que os organismos compartilham um ancestral comum. Ao investigar a função de uma determinada proteína na levedura, os pesquisadores ganham uma visão da função da proteína em eucariotes mais altos, como nós, humanos.

Na natureza, s. cerevisiae é encontrada em ambientes quentes e úmidos, com uma fonte de açúcar próxima à mão. Um de seus pontos favoritos é o vinhedo, onde habita na pele da uva.

S. cerevisiae tem uma forma de ovoide redondo para elipsoidal e é tipicamente de 5 a 10 micrômetros de diâmetro quando visualizado usando um microscópio de campo brilhante.

Quando a maioria das células eucarióticas se dividem através de mitose e citocinese, há uma segregação igual de material genético e citoplasma em células filhas. Por outro lado, S. cerevisiae passa por divisão celular através de um processo chamado brotamento.

Esta forma de reprodução assexual envolve a formação de um broto recém-sintetizado a partir da célula mãe, que cresce em tamanho ao longo do ciclo celular até a citocinese. Ao contrário da divisão típica de células eucarióticas, as duas células não são iguais em tamanho após a mitose.

Agora que aprendemos um pouco sobre S. cerevisiae como um organismo, vamos discutir o que o torna um ótimo sistema modelo de pesquisa.

Primeiro, as células de levedura crescem rapidamente e se dividem aproximadamente a cada 90 minutos. Em segundo lugar, são fáceis de cultivar, e precisam apenas de técnica simples e instrumentação para propagação. Terceiro, sendo o primeiro organismo eucariótico a ter todo o seu genoma sequenciado, S. cerevisiae tem todas as suas sequências genéticas disponíveis publicamente através do banco de dados do genoma da levedura.

A manipulação genética da levedura também é extremamente prática. A maioria dos vetores S. cerevisiae, portadores de uma sequência de DNA de interesse, são vetores de transporte. Vetores de transporte são geralmente plasmídeos que podem se propagar em duas espécies diferentes, como E. coli e S. cerevisiae. Isso permite que a clonagem molecular seja realizada em E. coli, digamos, para incorporar o gene para proteína fluorescente verde de águas-vivas em um vetor de transporte, que pode ser introduzido na levedura para fazê-los brilhar.

O plasmídeo integrativo de levedura é um tipo de vetor de transporte que permite a incorporação de DNA estranho no genoma da levedura através de um processo chamado recombinação homóloga. Recombinação homóloga é uma troca de DNA entre sequências correspondentes ou similares que resulta em um cruzamento genético entre o vetor e o DNA genômico hospedeiro. Isso pode fazer com que um gene seja nocauteado, ou um gene seja trocado por outro. Além disso, uma vez que a recombinação homóloga resulta em integração ao genoma hospedeiro, a mudança genética persiste após a divisão das células de levedura.

Agora que você sabe o que torna a levedura tão conveniente para o estudo, vamos dar uma olhada por que essas criaturinhas têm sido tão importantes cientificamente. Há muito, muito tempo atrás, no início do 6º milênio B.C., a levedura estava envolvida na fermentação de uvas para fazer vinho. A levedura mais tarde desempenhou um papel no cozimento de pão no Antigo Egito.

Foi só em 1856 que Luis Pasteur identificou S. cerevisiae como o principal micróbio de fabricação de vinhos e panificação. Classificou a levedura como um anaerobe facultativo, que, na ausência de oxigênio, muda para fermentação, um processo que permite que a levedura metabolize açúcares e produz álcool como subproduto. Nesse processo, o piruvato, que é produzido pela glicólise, é reduzido ao acetilaldeído, que é então, graças à conversão de NADH para NAD+, reduzido ao etanol, o ingrediente definidor do vinho.

Saltando à frente para o século XX, a descoberta de proteínas que regulam o ciclo celular foi encontrada na levedura por Hartwell e Nurse.

O ciclo celular é uma série de eventos celulares que inclui a replicação adequada e a segregação do DNA nuclear antes que uma célula se divida. A identificação da cíclina proteica e da quinase dependente de cíclin, juntamente com a mudança em sua abundância relativa através da interfase e mitose, sugeriu que essas proteínas são os principais reguladores da divisão celular. A natureza altamente conservada dessas proteínas torna seu estudo em levedura valioso para entender o papel das quinases dependentes de cíclin em organismos multicelulares, como a desregulação do ciclo celular, que pode levar à divisão celular descontrolada, ou câncer.

Avançando para 15 anos depois, Blackburn, Greider e Szostak fizeram estudos inovadores na compreensão dos telômeros, bem como na descoberta de telômeras. Telômeros são sequências repetitivas de DNA no final de um cromossomo que impedem que o DNA genômico se degenere. A adição dessas sequências repetitivas é realizada por telômeras na extremidade flanqueada de 3' do cromossomo, e a complementação de nucleotídeos é seguida por polimerase de DNA na cadeia defasada. Telômeros têm implicações no envelhecimento à medida que esses segmentos de DNA ficam mais curtos ao longo da vida de um organismo.

Ainda mais recentemente, em 1992, Ohsumi e seus colegas descobriram genes que regulavam a autofagia, uma espécie de reciclagem celular. Durante a fome de nutrientes, organelas dispensáveis são engolidas por um autofagoso. O autofagossomo se fundirá com um lissomo, a fim de quebrar ainda mais as proteínas organellares aos aminoácidos essenciais para a fabricação de novas proteínas. A autofagia está envolvida nos importantes mecanismos celulares que protegem contra patógenos invasores e crescimento de tumores.

Há uma ampla gama de aplicações para o estudo da levedura. A levedura pode, por exemplo, ser usada para estudar mitofagia, que é a remoção de mitocôndrias danificadas por autofagossos. Esse processo tem implicações em doenças como Alzheimer e Parkinson. Neste vídeo, a autofagia é induzida em células de levedura com a adição de meio de fome de nitrogênio. Em seguida, as células são preparadas para microscopia de fluorescência, a fim de observar mitofagia em células famintas de nitrogênio.

S. cerevisiae é usado para expressar e purificar grandes quantidades de proteínas, por exemplo, a proteína reguladora de condutância de fibrose cística transmembrana. Neste vídeo, as células de levedura que carregam o plasmídeo CFTR são cultivadas em grandes culturas. Em seguida, a centrifugação das células é realizada a fim de separar os microsomos. Microsomos são vasos artefatosuais formados a partir do ânticulo endoplasmático quando as células são interrompidas. O isolamento e a purificação do CFTR a partir de microsomous permitirão que os cientistas estudem a estrutura da proteína usando métodos como cristalografia de raios-X.

A levedura também pode ser usada como um sistema modelo para estudos genéticos de proteínas de reparação de DNA humano. Essas proteínas detectam e consertam DNA danificado para evitar a proliferação de células portadoras de um genoma defeituoso, como células cancerígenas. Aqui você vê autores emplacando células de levedura com a proteína de reparação de DNA transformada, WRN, em placas de mídia seletivas. A morfologia celular de mutantes para WRN pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência, e a detecção dessa proteína no lisato celular é realizada através da execução de um gel de proteína para análise de Western Blot.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à S. cereviae. Neste vídeo revisamos: a história, biologia celular e molecular, e aplicações biomédicas de S. cerevisiae. Esperamos que você tenha gostado do nosso vídeo, e nós encorajamos você a compartilhá-lo com um broto.

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