תחזוקת שמרים

התגליות החשובות של ויסות מחזור התא, פעילות הטלומראז, ואוטפגיה ב Saccharomyces cerevisiae, הוכיחו כי מין שמרים זה אורגניזם מודל יקר למחקר. שמרים קלים לגידול, פלסמידים שמרים וזנים זמינים מסחרית. למרות הדרישות הזולות יחסית עבור שמרים culturing, תחזוקה של אורגניזם זה היא קריטית לניסויים מוצלחים. וידאו זה ייתן לך מבט מבפנים כיצד לגדל תרביות תאי שמרים ולשמור על זני S. cerevisiae במעבדות.

בביולוגיה, עקומות גדילה מייצגות את השינוי באוכלוסיית התאים לאורך תקופה של זמן. בשמרים, עקומת הצמיחה נוצרת על ידי התוויית הצפיפות האופטית, או "OD", של תרבית התא ב 600 ננומטר בציר y וזמן על ציר x. צפיפות אופטית או "ספיגה" הוא היחס הלוגריתמי של עוצמת האור הנכנסת למתלי תא השמרים לעוצמה העוברת דרכו. מנת יתר המידה בסוף גל מסוים של אור נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר.

בעת עבודה עם שמרים, עקומת הצמיחה של זן שמרים צריך להיווצר על ידי לקיחת מדידות OD במרווחי זמן שונים. עקומת הצמיחה של השמרים מחולקת לשלושה שלבים עיקריים: עיכוב, לוגריתמי ושלב נייח. במהלך שלב ההשהיה, התאים מסתגלים לסביבה וגדלים בגודלם אך אינם מתחלקים. בשלב יומן הרישום, התאים מתחלקים באופן פעיל ובכך מובילים להכפלת תאים. לאחר חומרים מזינים זמינים מרוקנים, תאי שמרים נכנסים לשלב נייח, שבו חלוקת התאים מאטה ואוכלוסיית התאים נשארת קבועה.

באמצעות עקומת הצמיחה, ניתן לחשב את זמן ההכפלה של הזן באמצעות המשוואה הבאה: OD1 ו- OD2 מייצגים מדידות צפיפות אופטית, ו- T1 ו- T2 הם הזמן בין המדידות. זמן ההכפלה מוגדר כזמן הנדרש עבור אוכלוסיית תאים כדי להכפיל את מספר התא. חשב בין שני ערכי OD של שלב יומן הרישום, לדוגמה, בין ערכים 0.2 ו- 0.5 כפי שמוצג כאן. שמרים מסוג בר צריכים לתת ערך זמן הכפלה של כ 90 דקות.

לדעת את זמן ההכפלה מועיל שכן זה יאפשר לך לתכנן את הניסויים שלך בהתאם לאורך כל היום.

עכשיו שכיסינו את האגוזים והבריחים של עקומת הצמיחה של השמרים, בואו נתקדם למעבדה ונעשה קצת ידיים על הכנה לגידול תאי שמרים. המרכיבים העיקריים של אמצעי הצמיחה העשירים — AKA שמרים - הם: תמצית שמרים, פפטונה ומקור סוכר. תמצית שמרים מכילה תוכן של תאי שמרים, למעט דופן התא, ומספקת חומצות אמינו, ויטמינים, פחמימות וחומרים מזינים אחרים הדרושים לצמיחה. פפטון מופק מבשר מן החי או חלב והוא המקור העיקרי של חומצות אמינו במדיה שמרים. מקור סוכר, בדרך כלל גלוקוז, מתווסף כפי שהוא מספק אנרגיה לתאים הגדלים.

לאחר המסת תמצית שמרים ופפטון במים, לחטא את התערובת באמצעות autoclave. כדי להפוך צלחות מדיה שמרים, להוסיף אגר למדיה הנוזלית, ויוצקים את התערובת לתוך צלחות, ומאפשרים לו להתמצק בטמפרטורת החדר. צלחות אלה ניתן להשתמש בעת פס זנים כדי לגדל מושבות שמרים.

עכשיו שכל התקשורת שלנו מוכנה, איך אנחנו מגדלים תרבויות של היצורים האלה מאפס? בראש ובראשונה, ודא שכל המכשירים, הפתרונות והמדיה סטריליים.

לאחר מכן, להשיג צלחת כדי פסים החוצה תאי שמרים. לא, לא פס כזה! פסים הוא התהליך של הפצת תרביות שמרים נוזליות על צלחת אגר באמצעות מכשיר סטרילי, כמו שאתה רואה כאן. סביב "פסים" מושבות בודדות ייווצרו, אשר נגזרים מתא שמרים יחיד, שניתן לקטוף, על מנת להשיג אוכלוסייה גנטית טהורה של תאי שמרים. לאחר צלחות פסים, הפוך את הצלחת ומניחים אותו בחממה 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. זוהי הטמפרטורה האופטימלית לצמיחת שמרים.

לאחר שהמושבות נוצרו, לחסן את תאי השמרים בנפח קטן של מדיה צמיחה. לחסן כאן פירושו לבחור מושבה אחת ולהציג אותה לתקשורת על ידי ערבוב זה בקצרה. לדגור על התרבות בשייקר 30 °C (30 °F) או סיבוב במשך 48 שעות.

כדי לגדל תרביות גדולות יותר של תאים, בדוק תחילה את OD600 של תרבית שמרים בת יומיים באמצעות ספקטרופוטומטר. הפוך את הדילול המתאים כך OD ההתחלתי הוא כ 0.1-0.2. לאחר דילול התאים, מניחים את הבקבוק בשייקר של 30 מעלות צלזיוס ומגדילים את התאים עד OD הרצוי.

השיעור החשוב הבא לאחר שלמד כיצד לגדל S. cerevisiae הוא כיצד לאחסן אותם לשימוש עתידי. שמרים הגדלים על צלחות ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד 3 חודשים. עם זאת, אם אתה רוצה לגדל תרבות חדשה, הקפד פסים מחדש את התאים על צלחת טריה הראשון לפני פיקוח.

כדי לאחסן מלאי של זני שמרים לתקופות ארוכות, aliquot התאים cryovials המכיל גליצריל. לאחר מכן ניתן לאחסן תאים ב -80 °C (70 °F), שם הם יכולים להישאר עד מספר שנים.

עכשיו, כשמדובר בגידול תאי שמרים, בואו נסתכל על האופן שבו אנו יכולים ליישם טכניקות חיוניות אלה במחקר מדעי. תאים בשלב הנייח יכולים לשמש לחקר גנים המווסתים את חוסר היציבות של דנ"א הגנום במהלך ההזדקנות. סרטון וידאו זה מציג את אוסף התאים מתרבות בת שלושה ימים. הם מצופים על מדיה סלקטיבית המונעת תאים שמרים נורמליים לגדול. רק תאים שרכשו מוטציה יכולים ליצור מושבות על הלוחות האלה. מספר המושבות על הלוחות פרופורציונלי לרמת חוסר היציבות הגנומית בתרבות.

דוגמה נוספת לחקר ההזדקנות היא על ידי ניתוח תוחלת החיים הכרונולוגית של תאי שמרים. הזדקנות כרונולוגית מציינת אובדן הכדאיות של התא על פני תקופה של זמן וניתן ללמוד על ידי גידול תרביות נוזליות כפי שמוצג כאן. בסרטון זה, המדען טוען תרבויות שונות על המפרט על מנת ליצור עקומות צמיחה, אשר יסייעו לקבוע את הכדאיות התא.

תאי שמרים מסוג בר בשלב העץ מייצגים תאים בריאים ונורמליים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור אברונים אאוקריוטים, כגון הריבוזום. בסרטון וידאו זה, באפשרותך לראות את טעינת התא מתנודה מתאים שנאספו בשלב יומן הרישום למעבר צבע סוכרוז. לאחר מכן, תאים מסובבים לריבוזומים משקעים וצג ספיגה משמש ליצירת פרופיל ריבוזום.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לבעלות ותחזוקה של סכרומייס סרביסיה. בסרטון זה סקרנו את עקומת הצמיחה של השמרים, הדגמנו כיצד לגדל תרביות תאים, והראינו לך כיצד לשמור על זני שמרים. תודה שצפיתם, ואל תשכחו להמליץ על הסרטון הזה לניצן.