נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

נדידת תאים היא תהליך דינמי ביותר. זה חשוב למספר תפקודים פיזיולוגיים כגון התפתחות עוברית תקינה, התגובה החיסונית, כמו גם תהליכי מחלה. לדוגמה, גרורות סרטניות ודלקת.

חקר נדידת התאים חשוב למגוון רחב של מדעים ביו-רפואיים כגון ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. ניתן לחלק את נדידת התאים לארבעה שלבים נפרדים מכנית של הארכה, היווצרות הידבקויות חדשות, התכווצות גוף התא, ולבסוף, ניתוק זנב. כאן נתאר שתי שיטות פשוטות לחקור בקפידה את האופי הדינמי של נדידת תאים במבחנה.

השיטה הראשונה היא תרבית תאים של בדיקת מתחם. בדיקה זו נמצאת בשימוש נפוץ ונגישה מאוד למעבדות עם הגדרות המעבדה הבסיסיות ביותר. תרבית התאים של מבחן המתחם היא בדיקה שבה באמצעות קצה פיפטה ושריטות שנוצרו על שכבה חד-שכבתית של תאים, חד-שכבת התא המשולבת תסגור עם הזמן את הפצע שנוצר קודם לכן.

ניתן לחקור את הדינמיקה של נדידת התאים בפירוט באמצעות צילום אופציות זמן או באמצעות תמונות בזק. ניתן למדוד את המרחק ולאורך זמן ניתן לחשב את המהירות שבה התאים נעו. השיטה הקשורה השנייה, בדיקת הנדידה והפלישה של תאי טרנסוול נגישה מאוד גם במעקב אחר ציפוי התאים על קרום טרנסוול.

ידוע גם בשם חדר ביידן. ניתן למדוד את יכולות הנדידה שלהם לעבר שיפוע מושך כימותרפיה. שני הליכי הניסוי הנגישים הללו הם בעלי ערך רב בתחומי מחקר רבים.

פרק שני, מתחם תרבית תאים, בדיקה. שלום, שמי קלווין ג'סטיס. אני סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר יאנג מהמחלקה לאונקולוגיה בבית הספר לרפואה ברודי באוניברסיטת מזרח קרוליינה.

והיום אדגים שני נהלים שמדדו את יכולות ההגירה והפלישה עם תאים במבחנה. הבה נתחיל כעת במתחם תרבית התאים. מאמר התאים המשמשים במתחם תרבית התאים.

ניתן לגדל את הבדיקה בצלחות תרבית רקמה באמצעות טכניקות תרבית תאים קונבנציונליות. כדי להתחיל לשאוב את מצע הגידול המשמש לגידול התאים יש לשטוף פעם אחת עם PBS, ואז להוסיף לצלחת שני מיליליטר עד 0.25% טריפסין EDTA ולהכניס אותו לאינקובטור למשך שלוש דקות. הסר את הצלחת מהחממה והוסף שלושה מיליליטר DMM בתוספת 10% FES.

הסר את המדיה מהצלחת והכניס אותה לצינור קונאלי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה לחמש דקות של 1500 סל"ד. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את התאים בשני מיליליטר DMM בתוספת 10% FES.

לאחר מכן ספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו. בסיום הספירה צלחת מספר תאים שיהפכו למתכנסים תוך 24 שעות. הכניסו את הצלחת לחממה למשך 24 שעות כדי לאפשר הצמדת תאים והתפשטותם.

הסר את הצלחת מהחממה והסתכל עליה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהצלחת מתכנסת ב-100%. הבא במכסה המנוע הביולוגי, השתמש בקצה פיפטה בזהירות מבלי לפגוע בצלחת תרבית הרקמות, צור פצע מראש הבאר לתחתית. לאחר יצירת הפצע עם קצה הפיפטה, שאפו את המדיה ושטפו בעדינות עם שני מיליליטר של מדיום גידול.

במקרה זה DMEM בתוספת 10% FES כדי לשטוף את כל הפסולת הקיימת, שוב, לשאוב את המדיה. לבסוף, הוסף שני מיליליטר של אמצעי גידול ואם זמין, הכנס את המחזה לתא מבוקר טמפרטורה ו-CO2 מתחת למיקרוסקופ. יכולת צילום דולג זמן במארז.

יכולת קיטועי הזמן אינה זמינה. צלם תמונה ראשונית של מיקום הסימן והבאר והכניס את הצלחת לחממה. אם צילום דולג זמן זמין, הגדר את יכולות קיטועי הזמן במיקרוסקופ.

נגדיר את הזמן שלנו ל-16 שעות. בתמונה שצולמה כל חמש דקות לאחר 16 שעות, ניתן להסיר את הצלחת מהתא ולשמור את התמונות שנרכשו במהלך הניסוי בכונן הבזק. הכנס את ה-USB למחשב ופתח את תוכנית Image J.

לחץ על קובץ. ייבא רצף תמונות. מצא את התמונות שצולמו במהלך הניסוי.

לחץ על הקובץ הראשון ולחץ על פתח. אפשרויות הרצף הבאות יופיעו. בחר את התמונה הראשונה ברשימת התמונות והוסף את ההפרשים הקבועים הדרושים עבור סרטון הווידאו.

כעת תראה את אפשרויות קורא ה- VI. בחר מה הכי טוב לבחור, להתנסות וללחוץ. בסדר. תוכנית Image J תיצור כעת סרטון, תשמור את הסרטון, תלחץ על קובץ, תשמור כ-VI או כל אפשרות אחרת שעשויה להתאים לניסוי שלך.

לאחר מכן ניתן לנתח את הסרטון במחקר התאים עבור תכונות הגירה שעשויות לעניין. מאפיינים אפשריים שניתן לחקור הם הרחבת La Malo Podal, התכווצות גוף התא וניתוק זנב. בהיעדר צילום אובדן זמן, ניתן להסיר את הצלחת שהונחה באינקובטור למשך 12 עד 16 שעות לאחר התמונה הראשונית.

יש לצלם שוב את האזור שצולם בתחילה ולהוסיף סרגל קנה מידה למדידות נוספות. לאחר מדידת הרוחב הראשוני של הפצע שנוצר בתמונה הראשונה, יש להמיר את הרוחב הנמדד בפיקסלים למיקרומטרים באמצעות סרגל קנה מידה. לאחר מכן, יש למדוד את רוחב הפצע של התמונות הסופיות בפיקסלים באותו אזור כמו קודם, ושוב, יש להמיר אותו למיקרומטרים באמצעות סרגל קנה המידה.

השלב האחרון הוא הפחתת הרוחב הסופי מהרוחב ההתחלתי כדי לקבל את הרוחב הכולל שהפצע נסגר בפרק הזמן המוקצב. יש לחלק את מרחק הנדידה הסופי הנמדד בזמן המוקצב למהירות המתחם ומיקרומטר לשעה. ניתן לחזור על שיטת תמונת המצב בבארות רבות במקום בגודל משתנה לניתוח כמותי יותר של נדידת תאים, פרק שלישי, בדיקת נדידת תאים וחדשנות באר טרנס.

כדי להתחיל, תחילה עליך לגדל את התאים המעניינים בצלחת תרבית רקמות לצורך ההליך. לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם PBS ונתקו את התאים המעניינים מצלחת תרבית הרקמה עם ניתוק התא, המאגר או הטריפסין. כמו כן, אנו מציעים לך לקרוא את הספרות המאחורי האופן שבו טריפסין עשוי להשפיע על התאים שאתה חוקר מכיוון שהשימוש בו עשוי להשפיע על התוצאות שלך.

לאחר ניתוק צנטריפוגה של 1500 סל"ד למשך חמש דקות, הסר ושאף את המדיה הקיימת, ולאחר מכן השהה מחדש תאים ו-0.1% BSA. פתחו את האריזה של תוסף Transwell והניחו אותה בתוך הבאר שתוכננה לגודלה הספציפי. אם אתה מבצע תחילה את בדיקת הפלישה של Transwell, הוסף מטריג'ל לחלק העליון של התוסף ודגירה למשך 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.

צלחת 100 מיקרוליטר של תמיסת תאים על גבי קרום הטרנסוול. דגירה למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב. מספר התאים המצופים תלוי בסוג התא וייתכן שיהיה צורך בניסויים הבאים.

כדי לקבוע מספר זה, השתמש בפיפטה כדי להוסיף בזהירות את חומר המשיכה הכימותרפי הרצוי מתחת לתוספת לתחתית הבאר. נסה לא להסיר את התוספת. זמן הדגירה תלוי בסוג התא.

הסר את תוספת הטרנסוול לאחר הדגירה והשתמש באפליקטור קצה כותנה כמה פעמים שצריך כדי להסיר בעדינות את עודפי המדיה והתאים שלא נדדו לתוך הממברנה מהחלק העליון של הממברנה. היזהר לא לפגוע בקרום. הוסף 600 עד 1000 מיקרוליטר של 70% אתנול לתא התחתון של ריק.

ובכן מניחים את התוספת לבאר עם 70% אתנול ודוגרים למשך 10 דקות כדי לאפשר קיבוע תאים. שוב, השתמש באפליקטור קצה כותנה כמה פעמים שצריך כדי להסיר את שאריות האתנול בתאים שלא נדדו לתוך הממברנה מהחלק העליון של הממברנה. הוסף 600 עד 1000 מיקרוליטר עד 0.2% סגול קריסטל לבאר ומקם את התוספת לתוכה לצביעה בתאים.

דגירה למשך 10 דקות. בדרך כלל הסר את עודפי הצבע הסגול הקריסטלי מהחלק העליון של הממברנה. לאחר מכן בזהירות רבה כדי להימנע משטיפת תאים נודדים, טבלו את הממברנה במים המזוקקים כמה פעמים שצריך כדי להסיר את סגול הקריסטל שנותר.

הניחו לקרום להתייבש כדי לראות את התאים באמצעות מיקרוסקופ. ניתן להסיר את הממברנה בזהירות עם האזמל ולהניח אותה על כיסוי זכוכית, או לראות את התאים עם התוספות עדיין בצוואה. בעזרת מיקרוסקופ הפוך יש לצלם תמונה של מספר שדות ראייה.

כדי לקבל ייצוג טוב של מספר התאים שהועברו, ניתן לספור את מספר התאים באמצעות כלי הספירה של Adobe Photoshop. הנתונים המצטברים עשויים להיות מתווספים לגרף עמודות לייצוג הטוב ביותר של התוצאות שלך. פרק רביעי, תוצאות מייצגות.

לאחר מכן, ניקח אתכם דרך כמה תוצאות מייצגות מבדיקת תרבית התאים של המתחם ומבדיקת נדידת התאים הטרנסוול. שתי שיטות קשורות לבחינת תנועתיות התאים כמתואר בסרטון זה, נתחיל בתרבית התאים של בדיקת המתחם. כאן אנו מציגים תמונות שצולמו ב-0, 4, 8 תוך 12 שעות.

כפי שניתן לראות, לאחר יצירת הפצע ניתן לצלם תמונות ולאורך זמן ניתן למדוד את מרחק סגירת הפצע. אנו מציגים את הנתונים שלנו באמצעות תרשים פיזור ועל ידי שימוש בשיטה שנדונה קודם לכן, אנו קובעים את מהירות סגירת הפצע לאורך זמן. יתר על כן, ניתן גם לחקור בפירוט את נדידת התאים הבודדים באמצעות צילום זמן-lapse.

במקרה זה, אנו מתקרבים לתאים בודדים במהלך סגירת הפצע, עוקבים אחר נדידתם לאורך זמן ומתבוננים בתנועתם ניתן לבחון בפירוט תכונות כגון הארכת קצה מוביל, נסיגת זנב ותנועה כללית. כעת תעבור על כמה תוצאות של בדיקת נדידת תאים רוחביים. כאן אנו מציגים שתי תמונות שצולמו של הממברנה ובעקבות בדיקת נדידת תאי הטרנסוול.

התמונה הראשונה מציגה את התוצאות ללא חומר משיכה כימו-אטרקטיבי כאשר הייתה נדידת תאים מועטה או ללא נדידת תאים דרך הממברנה. התמונה השנייה מציגה את התוצאות עם חומר כימואטרקטיבי שבו הייתה נדידת תאים מוגברת לממברנה. מימין, אנו מציגים את תוצאות הכימות של הניסוי שלנו באמצעות גרף עמודות עם קווי שגיאה המייצגים שגיאת תקן.

פרק חמישי, סיכום הנתונים המצטברים בעקבות בדיקת המתחם התרבותי של התא במבחן הנדידה או הפלישה של תאים רוחביים חושפים את יכולות הנדידה של תאים בסביבה דו-ממדית או בסביבה תלת-ממדית. ניתן להשוות תוצאות אלה לתוצאות אחרות כדי לחשוף נתונים שלא היו ידועים בעבר וזה גם עשוי להיות בקורלציה עם בדיקות ביוכימיות אחרות. שתי הבדיקות הנפוצות הקשורות הללו הן בעלות ערך ונגישות בקלות למערכי המעבדה הבסיסיים ביותר לביולוגיה של התא.

אנו מודים לך על שהצטרפת אלינו היום ומאחלים לך בהצלחה במאמציך המדעיים העתידיים.