快速分析和荧光显微镜图像的探索

该程序的总体目标是使用图像分析平台快速分析和探索荧光显微镜图像。这是通过首先将细胞接种到板中，向每个孔中添加扰动并孵育板来实现的。然后使用自动荧光显微镜采集图像，并使用 pheno loader 工具将图像半自动加载到 pheno ripper 图像分析平台上。

设置分析参数后，表型开膛手会自动识别图像中反复出现的块类型，并为每张图像生成表型图谱，可以使用表型浏览器进行探索。最终，最终的聚类图显示了不同条件和图像特征之间的关系，从而可以比较高通量成像筛选产生的复杂而微妙的表型。与需要自动识别单个细胞的现有方法相比，该技术的主要优点是它更快、更容易使用。

这种方法可以帮助回答生物医学领域的关键问题，例如不同的药物如何影响细胞过程。该程序从细胞培养和细胞固定开始，如文本方案中所述，使用特异性一抗、荧光标记的二抗和文本方案中的其他荧光染料对固定的细胞进行染色。细胞染色后，使用 落射荧光显微镜 采集图像。

在此示例中，我们对 1 个摄像头使用了 20 倍放大倍率。本宁。我们为每个孔采集了 16 张图像，总共 480 张图像。要分析图像，首先，从 pheno ripper 下载并安装 pheno ripper。

org 并启动 pheno ripper。要开始分析图像以半自动加载图像和相关元数据，请单击 file structure 以访问 pheno loader 中的 pheno loader。选择包含图像数据集的目录，并根据需要指定图像的文件扩展名。

筛选不用于分析的文件。单击 Define markers 以指定实验中使用的生物标志物并将其与图像相关联。具体而言，单击图像文件，然后选择唯一标识生物标志物的文件路径部分。

最后，为每个生物标志物输入一个名称。下一步是单击 define metadata。要将信息与每个图像关联，请单击图像文件，然后选择标识图像信息的文件路径的一部分。

将弹出一个要求提供组名称的窗口。输入名称。从文件名中提取的组成员将显示在组表中。

可用于分析结果的可视化。要添加文件名中不存在的其他信息，请单击 add additional information 按钮，然后选择 Add metadata group，并输入其他组名称。后跟预定义组的每个值，可以添加的其他组的数量没有限制。

最后，单击 create metadata file 以生成数据的 pheno ripper 可读注释，选择定义实验中重复的元数据字段以避免冗余采样。对于包含仿行的数据集，将它们分组在一起可以提高性能。接下来，单击 set parameters 以定义处理数据集所需的参数。

要定义的参数位于左侧面板上。右侧面板显示。数据集的示例。

单击左侧或右侧。在不同图像之间切换的箭头是选择合适的阈值以粗略识别图像的蜂窝部分。阈值是由 pheno ripper 预先计算的，但可以使用图像顶部提供的滚动条进行调整以改善细胞区域的突出显示。

如果所选阈值不适用于所有图像，请降低阈值以包括非蜂窝区域，而不是丢弃蜂窝区域。接下来，选择适当的块大小（以像素为单位），将图像细分为块网格。调整块大小，使每个单元格平均有 20 到 30 个块，以将网格叠加到图像上。

单击 block size 字段前面的复选框。如果自动缩放的图像没有显示具有所需相对强度的标记，或者需要从分析中删除标记，请使用调整通道强度选项来识别标记子集上的细胞区域。选择 channels used for threshold 选项 default。

其他参数的选择通常就足够了，但如果需要，可以调整它们。使用高级分析选项，通过按主应用程序面板上的 pheno rip 来运行分析。Pheno ripper 将自动识别图像中反复出现的块类型。

将根据其中不同块类型的分数为每个图像生成表型图谱。使用 pheno 浏览器探索图像的表型谱之间的关系。pheno 浏览器界面由四个面板组成。

左上方的面板是不同图像和实验条件之间相对相似性的图形表示。右侧的两个面板显示所选条件的示例图像。最后一个面板比较所选条件的表型谱。

首先，从数据处理菜单中关闭分组以检查单个图像。接下来，单击散点图中的异常值点并丢弃低质量的图像。确定哪个元数据字段定义基本比较单位。

例如，要比较 drugs，请将具有相同元数据字段 drug 值的图像组合在一起。现在，每个点使用基于可用元数据的数据显示菜单、颜色或标签点表示一种药物，以帮助可解释性。点之间的距离反映了相应实验条件的相对表型相似性。

更接近的点表明更多的相似性。通过选中 rotatable 复选框，可以旋转 3D 图。在按住鼠标左键的同时将鼠标拖到图表上。

选择两个不同的点以直接比较它们。图像面板将显示每个点的示例图像，条形图面板将显示最能区分这两个点的块类型。从 cluster gram 菜单中启动 cluster gram，通过对模块类型和条件进行分组，提供更全面的模块类型和实验条件之间关系的视图。

这种表示突出了最能区分条件组的细胞表型。Pheno ripper 用于分析经 DNA Acton 和 α 微管蛋白荧光染色的 hela 细胞，并在用组蛋白脱乙酰酶处理后成像，抑制微管靶向和 DNA 损伤药物。这些图像的前景阈值设置为 5%，块大小设置为 20 像素，在标准台式计算机上对该数据集进行分析大约需要 10 分钟。

使用 pheno 浏览器界面来探索结果。图像之间的相对表型相似性使用多维缩放进行可视化。每个点代表一个由其药物作用机制着色的单个图像。

该图显示表型谱可用于按作用机制对药物进行分组。孔隙染色和空框等成像伪影很容易识别，因为它们作为明显的异常值脱颖而出。数据的聚类图将此分组与此处的表型谱相关联。

每行表示一种药物，每列表示一种块类型。灰度值反映了表型特征。较轻的值表示该块类型分层聚类的比例较高，这在很大程度上按药物类别分隔不同的药物。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 10 分钟内完成。按照此过程，可以执行其他方法，例如 IRA 分析。这将有助于回答其他问题，例如不同的基因如何影响相似的通路。