Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

O objetivo geral do procedimento a seguir é obter imagens de fluorescência de super-resolução que elucidem aspectos importantes da organização da vesícula em uma resolução inatingível com microscopia de fluorescência. Isso é feito primeiro transeccionando neurônios do hipocampo com codificação de DNA, quimeras fotoconversíveis de carga de vesículas. Na segunda etapa, imagens brutas com amostras esparsas são coletadas com o sistema de microscopia de super-resolução.

Em seguida, as imagens brutas são processadas para produzir uma imagem de super-resolução. Na etapa final, os dados são quantificados para elucidar a organização das vesículas. Em última análise, os perfis de linha de intensidade de pontos podem ser usados para comparar a separação de vesículas com a largura da vesícula, determinando assim se as vesículas estão próximas o suficiente para gerar um agrupamento Usando este procedimento.

A microscopia de localização fotoativada de cor única ou palma da mão pode ser usada para estudar a organização de organelas na maioria dos tipos de células cultivadas. Para iniciar o sistema de imagem de super resolução para aquisição de imagem, comece ligando a energia da lâmpada de arco. Em seguida, ligue o PC do sistema e os interruptores de componentes no controle remoto.

Ligue depois que o tablet de controle do microscópio for ligado, ligue o computador e inicie o software. Expanda a janela de status de inicialização para verificar se o sistema está carregando normalmente e escolha a opção iniciar sistema na caixa de diálogo de login. Para posicionar a amostra para visualização, abra os painéis frontal e superior no gabinete de segurança do laser e incline o braço de luz transmitido para acessar a platina e as objetivas.

Em seguida, coloque óleo no plano alfa APO Chromat 100 x reflexão interna total, fluorescência ou objetiva de grama. Em seguida, escolha uma objetiva de baixa ampliação para a etapa inicial de foco. Agora monte a amostra no palco e levante a objetiva em direção à amostra.

Monitorando a posição da lente usando a função X, Y, Z do tablet de controle. Pare quando a lente estiver no estádio de foco. Para visualizar a amostra e ajustar o foco.

Abaixe o braço leve e feche totalmente os painéis de acesso. Em seguida, na guia localizar, clique no símbolo de expansão ocular Para exibir um esquema do caminho da luz, escolha trans ativado e verifique se o esquema mostra a luz transmitida da lâmpada colidindo com a amostra. Olhe para as oculares e coloque as células em foco usando o tablet de controle como guia.

Em seguida, para identificar as células que expressam o DRA dois, escolha a luz refletida e o filtro apropriado para visualizar a emissão verde do covil dois. Digitalize a lamínula usando luz refletida de baixa intensidade até que uma célula brilhante saudável seja encontrada e, em seguida, configure o software para adquirir os dados da palma da mão. Alterne para a guia de aquisição e use o gerenciador de experimentos para carregar a configuração experimental apropriada de aquisição de palma.

Quando o menu pop-up aparecer com uma consulta sobre como ligar lasers, clique em sim Em seguida, para focar a imagem da célula no plano da câmera. Escolha apenas a faixa 488. Ajuste os parâmetros de aquisição, como o ganho E-M-C-C-D, e escolha a aquisição contínua.

Em seguida, ajuste a tela para o brilho desejado e mova a objetiva até que a imagem na tela esteja em foco. Em seguida, para coletar uma imagem de campo amplo convencional, clique no botão de pressão e salve a imagem. Para configurar a iluminação baseada em relva na pista 488, escolha relva no botão epi turf.

Para otimizar a iluminação baseada em grama, escolha a aquisição contínua e ajuste o ângulo da grama mais claro até que o fundo escureça repentinamente e a amostra possa ser focada em apenas um plano. Mude para a faixa 561 com o laser de 405 nanômetros desligado. Defina o ganho EMCD em cerca de 200 e o tempo de exposição em cerca de 50 milissegundos.

Escolha o filtro de emissão que transmite no vermelho e defina a intensidade do laser em cerca de 40%Verifique duas vezes o ângulo da grama para a pista 561. Para reduzir o plano de fundo, ilumine a amostra até que o plano de fundo desapareça. Usando a trilha 561 com apenas o laser 561 ativado.

Para coletar os dados da palma da mão, ligue o laser de 405 nanômetros para a trilha 561 e ajuste a intensidade do laser 405 para cerca de 0,01%Para monitorar a imagem da palma da mão computada durante a aquisição, expanda o menu de opções de processamento on-line e marque a palma da mão de processamento on-line para processar com os parâmetros padrão. Clique em iniciar experimento para iniciar a aquisição durante a coleta de dados, monitore visualmente a conversão de fotos, aumentando a intensidade do laser de conversão de fotos de 405 nanômetros. Quando a conversão de fotos da dentadura dois começa a diminuir.

Quando a conversão de fotos não aumentar mais após um aumento da intensidade do laser, clique em concluir etapa atual. Para encerrar o experimento, salve o arquivo. Para processar as imagens salvas, clique na guia de processamento, expanda o menu de métodos e expanda o submenu da palma da mão.

Escolha a palma da mão novamente entre as quatro subopções. Selecione a imagem apropriada para que ela apareça na janela de visualização. Expanda os parâmetros do método e clique em selecionar para inserir a imagem, expanda o campo de configurações e escolha padrão para executar a localização e localização de pico com as opções padrão.

Pressione aplicar na guia de processamento para calcular a imagem da palma da mão, que aparecerá em uma guia separada na janela de exibição para filtrar quaisquer componentes com amostragem incorreta nos dados. Use o teorema de amostragem de nyquist e a ferramenta remover outliers da palma da mão para excluir picos em regiões onde o espaçamento médio entre os picos, D minúsculo é muito grande para resolver uma vesícula de diâmetro, D maiúsculo com a imagem da palma da mão na janela de visualização, clique em selecionar para inserir a imagem e clique em aplicar. A nova imagem aparecerá em uma guia separada na janela de visualização para filtrar qualquer flora mal localizada. Quatro.

Vá para a guia de filtro PAL, limite a flora aceita. Quatro precisões de localização para um sigma de menos de 35 nanômetros. Para escolher um modo de exibição para a imagem da palma da mão, vá para a guia de renderização PAL, selecione uma resolução de pixel e o modo de exibição desejado.

Nesta imagem, um produto final representativo da palma da mão da imagem e processamento de uma vesícula de núcleo denso neuronal ou DCV é mostrado em vermelho. As coordenadas laterais dos quatros da flora localizada em branco são mostradas usando o modo de exibição Centro e a imagem de super-resolução da vesícula associada é mostrada usando o modo de exibição gaussiano. Nesta segunda figura, imagens análogas de campo amplo em verde e palma em vermelho do soma e processos proximais de um neurônio do hipocampo in vitro de oito dias expressando tpa, um perigo dois são exibidos.

Características importantes das imagens incluem a extensa correspondência um-para-um e sobreposição em amarelo entre o puncta e as imagens convencionais e palmares. O tamanho significativamente menor do ponto de palma e a resolução ocasional de um único ponto de campo amplo em vários pontos de palma. Aqui, uma imagem da palma da mão de D cvs ao longo de parte de um processo de um segundo neurônio do hipocampo expressando tpa.

DENDRA dois é mostrado. Observe o pequeno diâmetro e a aparência homogênea dos pontos e a observação pouco frequente de pontos opostos, que representam supostos aglomerados de DCV. Nesta figura final, é descrito um método quantitativo simples para determinar se dois ou mais cvs estão próximos o suficiente para compor um cluster.

Os perfis de linha das intensidades de pontos são gerados conforme mostrado nos gráficos, que podem ser usados para quantificar a separação e a largura do DCV. Se a separação exceder significativamente a largura, os CVS D não entram em contato um com o outro. Considerando que, se a separação for aproximadamente igual à largura, o CVS pode estar em contato com base nesses critérios, os cvs nesta imagem foram classificados como não em contato, enquanto os cvs nesta imagem foram classificados como em contato Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como a palma de duas cores, podem ser usados para estudar a localização relativa de estruturas distintas.