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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Reprodução de zebrafish e manuseio de embriões

Overview

O zebrafish (Danio rerio) é um importante organismo modelo que é particularmente valioso para pesquisas em biologia do desenvolvimento. Os zebrafish são extremamente férteis e podem produzir centenas de descendentes por semana, por isso é relativamente fácil coletar um grande número de embriões para altos números amostrais. Além disso, os zebrafish passam por rápido desenvolvimento e os embriões são transparentes, permitindo uma fácil visualização dos processos de desenvolvimento.

Este vídeo abrange os passos necessários para a coleta de embriões de zebrafish recém-fertilizados. Uma breve visão geral do comportamento de acasalamento de zebrafish é apresentada, seguida de instruções para a instalação de cruzes em tanques especializados de reprodução de laboratório que permitem o acasalamento controlado. Também estão cobertas as condições necessárias para iniciar a liberação de ovos (conhecidos como desova) na manhã seguinte ao conjunto dos tanques. Em seguida, são apresentadas técnicas essenciais para o trabalho com embriões, incluindo a inibição do desenvolvimento de pigmentos com a PTU química, e a descorionação: um procedimento no qual a membrana semelhante à concha em torno do embrião (o acorde) é removida. Finalmente, o vídeo termina com algumas aplicações práticas dessas técnicas em pesquisa de desenvolvimento.

Procedure

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Zebrafish são um pequeno, mas poderoso sistema de modelos. Esses peixes prolíficos podem gerar centenas de descendentes por semana e muitos milhares ao longo de suas vidas. Desenvolvimento externo rápido e corpos transparentes tornam os embriões ideais para diversas aplicações. Este vídeo abordará o básico da coleta e manuseio de embriões antes de descrever os métodos atuais de pesquisa que se aproveitam dos embriões de zebrafish.

Para gerar embriões, ajuda a saber um pouco sobre o comportamento de acasalamento de zebrafish.

Os zebrafish são submetidos à reprodução sexual, por isso a reprodução requer peixes machos e fêmeas. Os machos têm corpos mais finos com uma tonalidade ligeiramente vermelha, enquanto as fêmeas têm barrigas maiores e prateadas cheias de ovos.

O acasalamento periódico mantém os ovos saudáveis, mas fazer todos esses ovos requer muito trabalho, então as fêmeas individuais só devem ser acasaladas uma vez por semana.

Finalmente, como muitos outros animais, processos sensoriais guiam o comportamento de acasalamento em peixes.

Pistas olfativas do macho ajudam a deixar sua amiga pronta para desovar, enquanto um pouco de iluminação de humor coloca os dois em ação.

Tendo aprendido a identificar peixes machos e fêmeas, é hora de montar uma cruz.

Para a reprodução de zebrafish, os pesquisadores usam tanques especificamente projetados para acasalamento. Tanques de reprodução normalmente apresentam uma inserção removível com furos que permitem que os ovos caiam. Esta característica protege os ovos de serem comidos por peixes adultos famintos.

Para começar, misture peixes adultos em tanques de reprodução durante a tarde ou à noite. Para coletar embriões em estágio inicial na manhã seguinte, separe peixes machos e fêmeas com um divisor, o que os impede de procriar antes que você esteja pronto para começar um experimento. Para evitar que os peixes saltem para fora, certifique-se de cobrir o tanque de reprodução com uma tampa. Então, deixe os peixes se aclimatarem durante a noite.

Depois de passar a noite juntos em um tanque de reprodução, os peixes vão acasalar na manhã seguinte.

O primeiro passo da manhã é remover o divisor entre o peixe macho e fêmea para iniciar a desova. Se um divisor não for usado, o peixe colocará ovos logo após o início da luz.

Enquanto os machos perseguem as fêmeas ao redor do tanque, eles estimulam a desova de óvulos enquanto liberam esperma na água para fertilização. Espere aproximadamente 15 - 30 minutos depois de puxar um divisor para dar tempo ao peixe para acasalar. Em seguida, remova os adultos do tanque usando uma rede ou levantando a inserção do tanque e colocando o peixe em outro tanque.

Em seguida, despeje a água e os embriões através de um filtro de chá de malha para coleta. Em seguida, usando "água de ovo", lave os embriões do coador em uma placa de petri. Pode ser necessário transferir embriões entre pratos para alcançar uma densidade ideal de 50 a 100 por prato. Para garantir que o desenvolvimento prossiga em um ritmo normal, coloque os pratos em uma incubadora a 28,5 °C.

Uma vez que você tem seus embriões, lidar com eles com cuidado. Eles são importantes para suas experiências! Vamos passar por cima de algumas dicas.

Para manter os embriões saudáveis, certifique-se de manter a água nas placas de petri limpas e livres de detritos. Embriões mortos serão opacos e devem ser removidos diariamente. Além disso, o azul de metileno pode ser adicionado à água para evitar o crescimento fúngico.

Sempre que você precisar mover embriões de um prato para outro, use um pipet de transferência. Ao rodar o prato, você pode concentrar os embriões no centro da placa, facilitando a pipetação.

Alguns protocolos exigem alguns passos adicionais para a manutenção de embriões. Nos primeiros três dias de vida, os embriões de zebrafish se desenvolvem dentro de um chorão, o que pode impedir a manipulação do embrião. O acorde pode ser removido por tratamento com a enzima proteolítica, pronase ou usando fórceps para removê-lo manualmente. Além disso, os zebrafish começam a desenvolver pigmento em 24 horas, como mostrado aqui nesta larva de zebrafish, que pode interferir com a microscopia. Para ver através desse problema, os cientistas complementam a água embrionária com PTU, o que inibe a produção do pigmento melanina.

Agora que você sabe como obter e cuidar de embriões de zebrafish, vamos explorar algumas das maneiras que os pesquisadores os usam para descobertas científicas.

O desenvolvimento externo de embriões de zebrafish permite manipulação genética por microinjeção de DNA, RNA ou reagentes de knockdown genético. Este método leva à distribuição uniforme de material injetado em todo o embrião e pode produzir fenótipos visíveis resultantes da superexpressão ou perda de uma proteína. A mesma técnica também pode ser usada para fazer peixes transgênicos nos quais estruturas específicas são marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes.

Além disso, o pequeno tamanho de embriões de zebrafish e larvas os tornam ideais para triagem química fenotípica. Aqui, os embriões são carregados em placas de 96 poços e, em seguida, tratados com bibliotecas de pequenas moléculas adicionando os produtos químicos na água. Mais tarde, essas placas de peixe são rastreadas para defeitos morfológicos, como o desenvolvimento anormal mostrado aqui.

Finalmente, a transparência dos embriões de zebrafish os torna adequados para microscopia. Embriões vivos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células específicas podem ser montados e visualizados com microscopia confocal, permitindo que os pesquisadores examinem os movimentos celulares no desenvolvimento de tecidos ao longo do tempo.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre reprodução de zebrafish e manuseio de embriões. Neste vídeo, discutimos o básico do acasalamento, criação de tanques de reprodução e manuseio de embriões. Também discutimos alguns métodos de pesquisa que se aproveitam desse poderoso embrião. Obrigado por assistir!

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