Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

생쥐 지노타이핑

Overview

인간 게놈은 10년 전에 매핑되었지만 과학자들은 여전히 모든 인간 유전자의 기능을 이해하지 못하고 있습니다! 유전자 기능이 어떻게 작동하는지 평가하는 한 가지 방법은 그것을 코딩하는 서열을 중단하고 동물의 생물학에 대한 이 변경 (표현형)의 영향을 평가하는 것입니다. 이 접근법은 인간과 유전적 유사성의 높은 수준을 공유하기 때문에 마우스(mus musculus)에서일반적으로 사용됩니다. 여러 세대에 걸쳐 유전 적 변화를 베어링 동물을 추적하려면 유전으로 알려진 과정에서 각 마우스의 DNA를 검사해야합니다.

이 비디오는 지노피 마우스 뒤에 이론과 연습의 개요를 제공합니다. 토론은 마우스 유전학의 기본 원리로 시작, 용어 homozygote의 검토를 포함 하 여, 이종학, 야생 형, 돌연변이, 그리고 형질 전환. 다음으로, 마우스 조직에서 유전체 DNA를 추출하고 정화하기 위한 단계별 지침이 제공됩니다. 유전자를 해석하는 방법뿐만 아니라 원하는 유전자형을 가진 마우스를 추적하는 방법을 보여주는 예가 제공됩니다. 마지막으로, 이러한 일반적인 기술이 마우스 연구에 왜 그렇게 필수적인지 설명하기 위해 지노피 절차의 일부 대표적인 응용 프로그램이 발표될 것입니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genotyping은 특정 유기체의 게놈에서 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 과정입니다.

유전자는 마우스의 표현형에 영향을 미칠 수 있기 때문에 개별 마우스의 유전 메이크업 또는 "유전자형"을 조사 할 수 있다는 것은 특정 유전자에 표현형을 기인하는 데 중요합니다. 이 비디오는 마우스 유전학을 탐구하고, 유전 현상 절차의 중요한 단계를 시연하고, PCR 기지를 둔 유전 결과를 해석하는 방법을 설명합니다.

연구원이 유전자형 마우스를 볼 때 무엇을 찾는지 이해하기 위해 마우스 유전학에 대한 몇 가지 일반적인 조작을 검토합시다.

유전자를 연구하기 위하여는, 과학자는 유전 순서를 변경하여 그것의 기능을 수시로 중단합니다. 그러나, 마우스는 diploid, 그래서 그(것)들은 어떤 주어진된 유전자의 2개의 사본이 있습니다. 대부분의 유전자는 작동하기 위하여 단 하나 일반적인 사본이 필요하기 때문에, 마우스는 표현형을 공부하기 전에 중단된 두 유전자를 가진 동물을 일으키기 위하여 사육되어야 합니다.

이 유전자형은 "동종구 녹아웃"이라고 불리거나 더 일반적으로 짧은 "녹아웃"이라고 합니다. 반대로 두 개의 기능적 복사본이 있는 일반 마우스를 "동형 야생형" 또는 "야생형"이라고 합니다. 마지막으로, 하나의 기능적 사본을 가진 마우스는 "이종수구스" 또는 "hets"라고 합니다.

유전 물질을 제거하는 대신, 몇몇 실험은 마우스 게놈으로 DNA 순서의 소개를 요구합니다. 이 삽입된 DNA 단편은 "트랜스지니스"라고 불리고, 그(것)들을 운반하는 마우스는 "형질전환"입니다. 마우스에 도입된 가장 일반적인 "트랜스진"은 해파리에서 녹색 형광 단백질 또는 GFP의 발현을 유도하는 것입니다. GFP 생산을 구동하기 위해 조직 별 프로모터(유전자의 활성을 "촉진"하는 조절 서열을 사용함으로써, 특정 조직 유형으로부터의 세포는 녹색 형광에 의해 쉽게 식별될 수 있다.

많은 유전적 변화가 GFP 발현과 같이 쉽게 관찰 할 수있는 표현형으로 이어지지 않기 때문에 마우스는 실험에서 어떤 특정 동물을 사용해야하는지 결정하기 위해 유전자형이 필요합니다. 지평하기 전에, 마우스는 나중에 다시 확인할 수 있도록 주의 깊게 표시되어야 합니다. 아니요, 그보다 더 영구적인 것이 필요합니다. 한 가지 일반적인 방법은 노치의 위치와 수가 ID 번호에 해당되도록 귀에 노치를 만드는 것입니다.

마우스가 표지되면 DNA를 추출하는 작은 조직(일반적으로 2 ~5mm의 꼬리, 면도날 이나 가위를 사용하여)을 수집합니다. 두 개 이상의 마우스에서 조직을 수집하는 경우 블레이드의 사용 세그먼트를 표시하여 다음 동물에서 동일한 부품을 사용하지 않도록 하여 시료의 교차 오염으로 이어질 수 있습니다.

조직의 다른 성분으로부터 유전 물질을 분리하는 과정을 시작하기 위해, 샘플은 효소 단백질 효소 K를 함유하는 리시스 완충제에서 소화된다. 하룻밤 소화 후, 샘플은 펠릿 머리와 다른 소화되지 않은 물질에 원심 분리됩니다. 소화된 lysate에서 DNA를 분리하는 것은, 간단하고 효과적인 방법은 핵산을 침전시키기 위하여 알콜을 추가하는 것입니다. 잠깐 의복식 후, 샘플은 펠릿에서 DNA를 수집하기 위해 다시 원심 분리됩니다.

여분의 염을 제거하기 위해 70 % 에탄올로 세척 한 후 DNA 펠릿은 물이나 완충제에서 다시 중단되어 지노티핑을 할 준비가되어 있습니다.

특정 DNA 서열이 마우스에 존재하는지 여부를 결정하는 많은 전략이 있습니다. 그들 대부분은 먼저 중합체 연쇄 반응, 또는 PCR을 사용하여 관심의 유전 영역을 증폭할 것을 요구한다. PCR 을 설정하는 방법에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 "PCR 가이드"를 확인하십시오.

유전자형을 구별하는 한 가지 방법은 PCR 증폭 단편의 크기 변화를 감지하는 것입니다. 700개의 염기 쌍의 유전 삽입을 가진 마우스를 위해 검열하고 있다고 가정해 봅시다. PCR 후, 야생 형 밴드는 200 베이스 쌍이며, 트랜스 진 밴드는 900 베이스 쌍이어야한다.

PCR을 실행한 후 반응 제품을 적절한 백분율의 아가로즈 젤로 분리하여 조각의 크기를 구별할 수 있습니다. 야생형 컨트롤에는 200개의 베이스 쌍 와일드타입 밴드만 있어야 합니다. 형질전환 조절은 하나의 900베이스 쌍, 트랜스진 밴드만 있어야 한다; 그리고 het 컨트롤에는 두 밴드가 있어야합니다. 마지막으로 시약이 오염 DNA를 포함하지 않으므로 대역을 생성해서는 안 되도록 "템플릿 없음" 컨트롤이 포함되어 있습니다.

이제 우리는 컨트롤이 예상대로 작동 확신, 알 수없는 마우스를 체크 아웃 할 수 있습니다. 마우스 1과 2각각 하나만 가지고 있기 때문에, 그들은 동종 야생 형입니다. 마우스 4 및 6은 각각 하나의, 트랜스진 밴드가 있고, 따라서 동질형 형질성이다.

그리고 마우스 3과 5 각각 두 개의 밴드를 가지고 있으며, 따라서 hets입니다.

마지막으로, 원하는 유전자형으로 마우스를 찾으려면 귀 노치 패턴을 마우스의 ID 번호와 일치시켜야 합니다.

지노티핑이 무엇이고 어떻게 수행되었는지에 대한 이해를 얻은 후 유용한 이유에 대한 몇 가지 예를 살펴보겠습니다.

어떤 경우에는 원하는 표현형을 생성하기 위해 보다 복잡한 유전자 변형이 필요합니다. 예를 들어, 마우스에서 피부암의 이 모형을 설치하기 위하여는, 2개의 전이가 요구됩니다. 하나는 유도할 수 없는 "종양유전자" 또는 암을 유발할 수 있는 유전자를 운반하고, 두 번째는 피부 세포에서만 발현되는 효소 Cre 재조합효소를 운반하고 종양유전자 전사를 방지하는 서열을 소비하여 종양유전자 발현을 허용한다. 두 가지 유전자를 가진 자손을 생산하기 위하여는, 각각에 대한 마우스 이종화구우스는 짝짓기됩니다. 지노티핑은 원하는 자손을 식별하는 데 사용됩니다.

때로는 실험 전에 유전자형 마우스가 불가능할 수도 있습니다. 예를 들면, 배아 심박수의 이 연구 결과에서는, 그들의 행동을 방해하지 않고 태아에게서 지평을 위한 조직을 수집하는 것이 가능하지 않습니다. 따라서, 어머니 내의 배아 위치는 먼저 신중하게 표지되고 초음파 측정이 기록됩니다. 마지막으로, 꼬리 생검은 심박수에 유전자형의 효력을 결정하기 위하여 집합됩니다.

이 비디오는 DNA 추출의 한 가지 방법을 보여 주었지만 많은 변형이 있습니다. 예를 들어, 직접 PCR 시스템은 조직 소화의 5 분 미만이 필요합니다. 또한 소화되지 않은 물질을 회전한 후, 상체는 PCR에 대한 준비가 되어 DNA 정화의 필요성을 제거합니다.

당신은 단지 지평하는 쥐에 대한 JoVE의 가이드를 보았다. 이 비디오에서는 마우스 유전학의 기본 사항, 마우스 DNA 샘플을 준비하고 분석하는 방법뿐만 아니라이 기술의 몇 가지 실용적인 응용 프로그램을 검토했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter