Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

גנוטיפינג עכבר

Overview

למרות שהגנום האנושי מופה לפני יותר מעשר שנים, מדענים עדיין רחוקים מלהבין את תפקודו של כל גן אנושי! דרך אחת להעריך כיצד גן מתפקד היא לשבש את הרצף קידוד זה ולאחר מכן להעריך את ההשפעה של שינוי זה (פנוטיפ) על הביולוגיה של החיה. גישה זו משמשת בדרך כלל בעכבר (שרירים), שכן הוא חולק רמה גבוהה של דמיון גנטי עם בני אדם. כדי לעקוב אחר בעלי החיים הנושאים שינויים גנטיים במשך מספר דורות, יש צורך לסנן את ה- DNA של כל עכבר בתהליך המכונה genotyping.

וידאו זה מספק סקירה של התיאוריה והפרקטיקה מאחורי עכברי genotyping. הדיון מתחיל בעקרונות הבסיסיים של גנטיקה של עכברים, כולל סקירה של המונחים הומוזיגוטה, הטרוזיגוטה, wildtype, מוטציה ומהנדסת. לאחר מכן, הוראות שלב אחר שלב מסופקות לחילוץ וטיהור DNA גנומי מרקמת העכבר. דוגמאות מסופקות הממחישות כיצד לפרש תוצאות genotyping, כמו גם כיצד לעקוב אחר עכברים עם הגנוטיפ הרצוי. לבסוף, כמה יישומים מייצגים של הליך genotyping יוצגו על מנת להדגים מדוע טכניקה נפוצה זו היא כל כך חיונית למחקר עכבר.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genotyping הוא תהליך של גילוי נוכחות, או היעדר, של רצפי DNA ספציפיים בגנום של אורגניזם מסוים.

מאז גנים יכולים להשפיע על פנוטיפ של העכבר, היכולת לחקור את האיפור הגנטי של עכבר בודד, או "גנוטיפ", היא קריטית לייחס פנוטיפ לגן מסוים. וידאו זה יחקור גנטיקה של עכברים, להדגים צעדים מרכזיים של הליך genotyping, ולהסביר כיצד לפרש תוצאות genotyping מבוסס PCR.

כדי להבין מה חוקרים מחפשים כאשר הם עכברי גנוטיפ, בואו לסקור כמה מניפולציות נפוצות לגנטיקה עכבר.

כדי לחקור גן, מדענים לעתים קרובות לשבש את תפקודו על ידי שינוי הרצף הגנטי שלה. עם זאת, עכברים הם diploid, ולכן יש להם שני עותקים של כל גן נתון. מאז רוב הגנים צריכים רק עותק נורמלי אחד לתפקד, העכברים חייבים להיות bred כדי לייצר בעל חיים עם שני הגנים שיבש לפני לימוד פנוטיפ.

גנוטיפ זה נקרא "נוקאאוט הומוזיגוס", או בדרך כלל רק "נוקאאוט" בקיצור. לעומת זאת, עכבר רגיל עם שני עותקים פונקציונליים נקרא "סוג פראי הומוזיגוס", או סתם "wildtype". לבסוף, עכברים עם עותק פונקציונלי אחד בלבד מכונים "הטרוזיגוס", או "hets".

במקום להסיר חומר גנטי, ניסויים מסוימים דורשים הכנסת רצפי DNA לגנום העכבר. שברי הדנ"א המוחדרים האלה נקראים "טרנסג'נים", והעכברים הנושאים אותם הם "מהונדסים". "טרנסג'ן" הנפוץ ביותר שהוכנס לעכברים הוא כזה שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP, ממדוזות. באמצעות מקדם ספציפי לרקמות (רצף רגולטורי ש"מקדם" את פעילותו של גן) כדי להניע את ייצור GFP, תאים מסוג רקמות מסוים יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי פלואורסצנטיות ירוקה.

מכיוון ששינויים גנטיים רבים אינם מובילים לפנוטיפ שניתן להבחין בו בקלות, כמו ביטוי GFP, יש לגנוטיפיד עכברים כדי לקבוע איזו חיה ספציפית יש להשתמש בניסויים. לפני genotyping, עכברים צריכים להיות מתויגים בקפידה, כך שהם יכולים להיות מזוהים שוב מאוחר יותר. לא, תצטרך משהו יותר קבוע מזה. שיטה נפוצה אחת היא לעשות חריצים באוזן, כך המיקום ומספר החוזים תואמים למספר מזהה.

לאחר שהעכבר מסומן, לאסוף חתיכה קטנה של רקמה (בדרך כלל 2 - 5 מ"מ של זנב, באמצעות סכין גילוח או מספריים) שממנו לחלץ DNA. אם אתה אוסף רקמה מיותר מעכבר אחד, סמן את המקטעים המשומשים של הלהב כדי להבטיח שלא תשתמש באותו חלק על החיה הבאה, מה שעלול להוביל לזיהום צולב בדגימות שלך.

כדי להתחיל בתהליך של הפרדת החומר הגנטי מרכיבים אחרים של הרקמה, המדגם מתעכל במאגר תמוגה המכיל את האנזים proteinase K. לאחר עיכול לילה, המדגם הוא צנטריפוגה כדי גלולה שיער וכל חומר אחר מעוכל. כדי לבודד את הדנ"א מהליסאט המעוכל, שיטה פשוטה ויעילה היא להוסיף אלכוהול לחומצות גרעין מזרזות. לאחר דגירה קצרה, המדגם הוא צנטריפוגה שוב כדי לאסוף את ה- DNA בכדור.

לאחר כביסה עם 70% אתנול כדי להסיר מלחים עודפים, כדורי ה- DNA הוא resuspended במים או חוצץ והוא מוכן genotyping.

ישנן אסטרטגיות רבות כדי לקבוע אם רצף DNA מסוים קיים בעכברים שלך. רובם דורשים ממך תחילה להגביר את האזור הגנטי של עניין באמצעות תגובת שרשרת פולימראז, או PCR. לקבלת מידע נוסף על אופן הגדרת PCR, עיין ב"מדריך לחינוך מדעי JoVE ל- PCR".

שיטה אחת להבחין בין גנוטיפים היא לזהות שינויים בגודל של קטע מוגבר PCR. נניח שאתה מסנן לעכברים עם החדרה גנטית של 700 זוגות בסיסים. לאחר PCR, רצועות wildtype הן 200 זוגות בסיסים, ולהקות טרנסג'ן צריכות להיות 900 זוגות בסיסים.

לאחר הפעלת ה- PCR, הפרד את מוצרי התגובה בג'ל אגרוז באחוזים מתאימים, כך שתוכל להבחין בין הגדלים של השברים שלך. בקרת wildtype צריך להיות רק 200 בסיס זוג wildtype הלהקה; השליטה הטרנסגנית צריכה ללדת רק זוג בסיס אחד של 900, רצועת טרנסג'ן; ולשליטת ההט צריכות להיות שתי להקות. לבסוף, פקד "ללא תבנית" כלול כדי לוודא שהריגנטים אינם מכילים דנ"א מזהם, ולכן לא אמורים ליצור רצועות כלשהן.

עכשיו שאנחנו בטוחים שהבקרות עבדו כצפוי, בואו נבדוק את העכברים הלא ידועים. מכיוון שלעכברים 1 ו-2 יש רק להקת wildtype אחת, הם סוג פראי הומוזיגוס. לעכברים 4 ו-6 יש רק להקה טרנסג'נית אחת, ולכן הם מהונדסים הומוזיגוס.

לעכברים 3 ו-5 יש שתי להקות, ולכן הם הטס.

לבסוף, כאשר אתה חוזר למצוא את העכברים עם הגנוטיפ שאתה רוצה, אתה רק צריך להתאים את התבנית של חריצים האוזן עם מספר הזיהוי של העכבר.

לאחר קבלת הבנה של מהו גנוטיפינג וכיצד הוא נעשה, בואו נסתכל על כמה דוגמאות מדוע הוא שימושי.

במקרים מסוימים, שינויים גנטיים מורכבים יותר נדרשים כדי לייצר את הפנוטיפ הרצוי. לדוגמה, כדי להקים מודל זה של סרטן העור בעכברים, נדרשים שני טרנסגנים. אחד נושא "oncogene" מושרה, או גן שיכול לגרום לסרטן, והשני נושא את האנזים Cre רקומבינאז, אשר בא לידי ביטוי רק בתאי העור excise רצף המונע שעתוק oncogene, ובכך מאפשר ביטוי oncogene. כדי לייצר צאצאים עם שני הטרנסגנים, עכברים הטרוזיגוס עבור כל אחד מהם הם מזווגים. גנוטיפינג משמש לאחר מכן לזיהוי הצאצא הרצוי.

לפעמים זה לא יכול להיות אפשרי גנוטיפ עכברים לפני ניסוי. לדוגמה, במחקר זה של קצב הלב העוברי, זה לא ריאלי לאסוף רקמה עבור genotyping מן העוברים מבלי לשבש את התנהגותם. לכן, תנוחות העובר בתוך האם מסומנות תחילה בקפידה, ואז מדידות אולטרסאונד נרשמות. לבסוף, ביופסיות זנב נאספים כדי לקבוע את ההשפעה של הגנוטיפ על קצב הלב.

וידאו זה הדגים שיטה אחת של מיצוי DNA, אבל יש וריאציות רבות. לדוגמה, מערכת PCR ישיר דורש פחות מחמש דקות של עיכול רקמות. בנוסף, לאחר ספינינג למטה חומר מעוקל, supernatant מוכן PCR, ביטול הצורך בטיהור DNA.

הרגע צפית במדריך של ג'וב לעכברי גנוטיפינג. בסרטון זה, סקרנו את היסודות של גנטיקה של עכברים, כיצד להכין ולנתח דגימות DNA של עכבר, כמו גם כמה יישומים מעשיים של טכניקה זו. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter