Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, reine axonale Präparate zu erhalten, die für die Untersuchung durch konventionelle, biochemische oder immunzytochemische Techniken geeignet sind. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Spinalganglienzellen auf Kultureinsätzen kultiviert werden, die einen porösen Membranfilter tragen, während die DRG-Neuronen Axone verlängern. Einige der Axone wachsen durch Poren im Filter und erstrecken sich auf seiner unteren Oberfläche, während die Zellkörper auf der oberen Oberfläche isoliert bleiben. Nach den gewünschten experimentellen Manipulationen wird die axonale Präparation erhalten, indem die Zellen auf der Oberseite der Filter physikalisch entfernt werden, während die Axone, die auf der Unterseite gewachsen sind, erhalten bleiben.

Letztendlich können die isolierten Axone für biochemische Analysen liegen oder für immunchemische Untersuchungen fixiert werden, indem reine axonale Proben hergestellt werden, die für die Analyse mit herkömmlichen biochemischen Techniken geeignet sind. Dieses Verfahren hat sich als sehr nützlich erwiesen, um die Physiologie und Pathophysiologie von Axonen zu untersuchen. Wie Sie sehen werden, ist die Technik relativ einfach zu implementieren und kann an bestimmte experimentelle Umgebungen angepasst werden.

Wir werden seine Verwendung bei der Untersuchung von axonalen Degenerationsmechanismen am Tag vor der Plattierung demonstrieren. Beginnen Sie damit, die Filter unter einer sterilen Gewebekulturhaube zu beschichten. Erster Platz, 24-Millimeter-Filtereinsätze in einer Sechs-Well-Aufnahmeplatte.

Geben Sie dann zwei Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter, Poly de Lycin in Wasser in das untere Fach und einen Milliliter in das obere Fach und inkubieren Sie die Einsätze eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Ihr nächstes Aspirat, das Poly de Lycine, wobei darauf geachtet wird, die Flüssigkeitsreste zu entfernen, die direkt unter dem Filter eingeschlossen sind. Spülen Sie dann nach dem Ansaugen des Wassers einmal mit Wasser ab, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Platten über Nacht in der Haube trocknen.

Am nächsten Morgen eine Laminat-Wasser-Lösung bei 37 Grad Celsius mischen und erwärmen. Inkubieren Sie die Inserts in der Lamininlösung eine Stunde lang in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius unter Verwendung von Standardvolumina. Nach dem Aspirieren.

Das Laminin fügt 0,1 Milligramm pro Milliliter hinzu, Kollagen in Wasser und inkubiert eine Stunde lang bei Raumtemperatur, aspiriert dann das Kollagen und wäscht es einmal mit sterilem Wasser. Die Filter sind nun bereit für die Aufnahme von Nährmedien und DRG-Explan, nachdem ein E 13-Mausembryo wie im Textprotokoll beschrieben präpariert und geköpft wurde. Legen Sie den Embryo auf die Seite in eine mit L 15-Medien gefüllte Petrischale, während Sie ihn durch ein Präpariermikroskop betrachten, und machen Sie einen Schnitt an den Seiten, um die Brust, den Bauch, die Gliedmaßen und den Schwanz zu entfernen.

Legen Sie den Rücken mit der Bauchseite der Wirbelsäule nach oben und entfernen Sie alle viszeralen Organe mit einer kleinen Federschere. Legen Sie das gesamte Rückenmark frei, indem Sie die Wirbelsäule von ihrer ventralen Seite entlang der Mittellinie durchtrennen. Halten Sie den Kadaver mit einer Zange Nummer drei fest und halten Sie das Rückenmark mit einem zweiten Paar an seiner rostralsten Seite fest.

Ziehen Sie nun die Nabelschnur langsam und sanft von der Wirbelhöhle weg. Wenn die DRGs freiliegen, verwenden Sie eine ultradünne Pinzette Nummer fünf, um sie vom Rückenmark abzuklemmen. Legen Sie die abgelösten DRGs mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, die zur Vergrößerung abgeschnitten wurde, auf den Boden der Schale.

Seine Eröffnung. Aspiriere die gesammelten DRGs und lege sie in eine Röhre auf Eis. Ergänzen Sie das Medium des unteren Fachs mit 15 Nanogramm pro Milliliter NGF, während das obere Fach NGF frei bleibt.

Geben Sie anschließend vollständige DRG-Medien bei 37 Grad Celsius zu den beschichteten Einsätzen unter Verwendung von Standardvolumina. Verwenden Sie dann eine 1000-Mikroliter-Pipette mit einer Spitzenblende, um die Öffnung zu vergrößern. Stellen Sie die Pipette auf 800 Mikroliter ein.

Übertragen Sie dann etwa 200 Mikroliter Medium von der Oberseite des Filters in die DRG-enthaltende Röhrchenpipette, ein kleines Volumen nach oben und unten, um die auf den Boden gesunkenen D-RRGs wiederzubeleben. Nach der Resuspendierung aspirieren Sie das gesamte Volumen, übertragen Sie nun die DRGs in den Filter, indem Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Einsatzes eintauchen und die DRGs ausstoßen. Halten Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius.

Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, um das Medium zu wechseln. Saugen Sie zuerst das obere Fach an, dann das untere. Geben Sie frisches Medium in Standardvolumina hinzu, beginnend mit dem unteren Kompartiment, um die Auswirkungen des trophischen Faktorentzugs auf Axone zu untersuchen.

Warten Sie zwei Tage, um die axonale Ausdehnung zu ermöglichen. Entfernen Sie anschließend das Medium aus dem oberen und unteren Fach. Dann werden verbleibende oder endogen produzierte Medien sequestriert, und GF fügt Medien hinzu, denen NGF fehlt und die Anti-NGF-Antikörper enthalten.

Bringen Sie die Platten wieder bei 37 Grad Celsius in den Zellinkubator zurück, damit die durch den NGF-Entzug induzierte Degeneration für die gewünschte Zeit zur Untersuchung während der Arianerdegeneration fortgesetzt werden kann. Verwenden Sie Filter, die DRG explan enthalten, der zwei Tage lang in NGF gepflegt wird. Verwenden Sie einen Zellschaber, um DRGs von der Oberseite des Filters abzukratzen.

Sorgen Sie für die vollständige Entfernung der neuronalen Zellkörper, indem Sie den Schaber in x- und y-Richtung und in Kreisen hin und her bewegen. Bestätigen Sie den Erfolg des Schabens, indem Sie überprüfen, ob keine X Pflanzen am Filter haften. Als nächstes verwerfen Sie das Medium mit den schwimmenden Explantaten aus dem oberen Fach und fügen Sie einen Milliliter vorwärmtes vollständiges DRG-Medium mit 10 Nanogramm pro Milliliter und gf hinzu.

Dann wird die Platte wieder bei 37 Grad Celsius in den Zellinkubator gestellt, damit die Waller'sche Degeneration für die gewünschte Zeit ablaufen kann, um Protein aus den axonalen Proben zu extrahieren. Füllen Sie zunächst 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen mit 75 Mikrolitern Lammblatt-Probenpuffer und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Waschen Sie den Filter mit dem DRG-Explan in PBS und kratzen Sie die Oberseite des Filters wie zuvor ab.

Nachdem Sie den Einsatz von der Platte entfernt haben, verwenden Sie einen Wattestäbchenapplikator, um die Oberseite des Filters zu reinigen. Saugen Sie dann überschüssiges PBS von der Ober- und Unterseite an. Legen Sie dann den Einsatz kopfüber auf eine Bank und schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell den Filter aus dem Einsatz.

Halten Sie dann den Filter mit einer Pinzette fest. Von unten nach oben. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt vom Umfang bis zur Mitte des Filters.

Legen Sie nun den Filter auf das Auffangrohr und drücken Sie mit einer Pinzette die Mitte des Filters nach unten. Dabei bildet sich ein Trichter, der den trichterförmigen Filter auf den Boden des Röhrchens drückt, so dass er in den Laly-Probenpuffer eingetaucht wird. Schließen Sie nun die Proteinextraktion ab, indem Sie die Röhrchen abdecken und vier Minuten lang in kochendes Wasser legen.

Entfernen Sie den Filter mit einer Pinzette und setzen Sie ihn kopfüber in den oberen Teil des Röhrchens ein und zentrifugieren Sie ihn kurz. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie die getrockneten Filter für die Immunfluoreszenz. Waschen Sie die Einsätze in PBS in Sechs-Well-Platten.

Fixieren Sie dann die Einsätze in frisch aufbereitetem 4%Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker nach der Fixierung, kratzen und reinigen Sie die Oberseite der Einsätze, um sicherzustellen, dass nur Axone fleckig werden, die ausschließlich auf der Unterseite des Filters gewachsen sind. Führen Sie dann die Standard-Immunfluoreszenz durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald alle Immunfluoreszenz-Inkubationen abgeschlossen sind.

Gießen Sie das PBS von der letzten Wäsche ab. Reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Wattestäbchenapplikator und saugen Sie die restliche Flüssigkeit von der Ober- und Unterseite ab. Legen Sie den Einsatz verkehrt herum auf die Bank und schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell den Filter aus dem Einsatz.

Halten Sie dann den Filter mit der Pinzette nach oben. Legen Sie es auf einen Objektträger. Legen Sie mit fluoreszierenden Eindeckmedien einen Deckglas über den Filter und lassen Sie den Filter im Dunkeln bei vier Grad Celsius flach trocknen.

Zum Schluss wird die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht und aufgenommen. Die sequentielle Beschichtung von Filtern mit Polylysin, Laminin und Kollagen führt dazu, dass Pflanzen im Vergleich zu solchen, die mit Polylysin allein oder Polylysin und Kollagen unter demselben Substrat angebaut werden, mehr und längere Axone bilden. Bedingungen der Beschichtung.

DRG Explan, das auf Filtern gepflegt wird, zeigt ein deutlich stärkeres axonales Wachstum als X-Pflanzen, die auf Kunststoff angebaut werden. Das axonale Präparat, das nach dem Schaben der Oberseite des Filters erhalten wird, ist frei von Zellkernen, was zeigt, dass Zellkörper von der Unterseite des gezeigten Filters ausgeschlossen sind. Hier sind Beispiele von Axonen, die von etwa 17 Explan stammen, die sich durch die Filterporen erstreckten, um auf der Unterseite eines 24-Millimeter-Filters zu wachsen.

Immun-Blots von Lysaten, die von Filteroberseiten im Vergleich zu Filterböden gesammelt wurden, zeigen, dass Histon H drei, ein nukleärer Marker, auf die Filteroberseiten beschränkt ist. Der Gesamtproteingehalt wurde über die verschiedenen Proben hinweg normalisiert. Die NGF-Deprivationsexperimente sind in diesen Bildern bei unterschiedlichen Vergrößerungen von axonalen Präparaten aus Explan demonstriert, die in NGF gehalten oder 12 oder 36 Stunden lang von NGF entzogen wurden.

Die Studien zur arianischen axonalen Degeneration der Wand sind in diesen Bildern von axonalen Präparaten aus intakten Explantaten oder drei bis 7,5 Stunden nach der Durchtrennung gezeigt, wie in anderen Modellen der Wallerschen Degeneration. Fünf Millimolare NAD plus schützt vor transsektionsinduzierter Degeneration Einmal gemeistert. Diese Technik ist robust und einfach zu reproduzieren.

Es ermöglicht die Erzeugung großer Mengen zuverlässiger axonaler Präparate Seit der Erstbeschreibung durch twist und Kollegen im Jahr 2001. Variationen dieser Technik wurden verwendet, um viele Aspekte der Axon- und Dendritenphysiologie zu erforschen. Beziehen Sie sich auf die Zitate im Textprotokoll, um weitere Anwendungen dieser Technik zu entdecken.