Overview
המבנה המורכב של מערכת העצבים החולייתית נובע מסדרה מורכבת של אירועים הכוללים בידול תאים, העברת תאים ושינויים במורפולוגיה של התאים. לימוד תהליכים אלה חיוני להבנתנו את תפקוד מערכת העצבים, כמו גם את היכולת שלנו לאבחן ולטפל בהפרעות הנובעות מהתפתחות חריגה. עם זאת, רקמות עצביות אינן נגישות יחסית למניפולציות ניסיוניות, במיוחד ביונקים עובריים. כתוצאה מכך, מדענים רבים מנצלים את התרבות המסבירה כדי לחקור תהליכים נוירו-מפותחים בסביבה "אורגנוטיפית", כלומר הרקמה מוסרת מהאורגניזם אך הארכיטקטורה התאית המורכבת שלה נשמרת. בדרך כלל, תרביות explant נוצרות על ידי ניתוח זהיר של רקמה עצבית כי הוא שקוע אז בתקשורת צמיחה שתוכננה בקפידה ו מתורבת במבחנה.
וידאו זה יספק תחילה סקירה קצרה של תרבות explant עצבית, כולל היתרונות שלה על שיטות במבחנה אחרות ושיקולים חשובים לשמירה על רקמות בריאות. לאחר מכן, פרוטוקול כללי יסופק להגדרת תרבות מסבירה ממוחו של העכבר העוברי, המתאר את בידוד העוברים מהאם ואת ניתוח המוח. המצגת כוללת גם סקירה של תרבות הפרוסה, שבה נוצרים חלקים דקים של רקמת מערכת העצבים לשיפור הגישה החזותית לתאים המתפתחים. לבסוף, כמה יישומים של טכניקות אלה יסופקו כדי להדגים כיצד הם יכולים לשמש כדי לענות על שאלות חשובות בתחום neurodevelopmental.
Procedure
תרבויות Explant לשמש טכניקה לחקור את הפיתוח של אוכלוסיות תאים ספציפיים ומבנים עצביים. בניסויים התפתחותיים במדעי המוח, explants הם רקמות עצביות שנפלטו מעובר להמשך התפתחות במבחנה. תרבויות אלה נותנות לחוקרים את היכולת לתפעל ולדמיין את הרקמות המתפתחות בדרכים שאינן אפשריות ב- vivo. וידאו זה יציג כמה עקרונות חשובים מאחורי עבודה עם רקמות מוסברות, נהלים צעד אחר צעד עבור שתי גישות לתרבות explant, כמו גם יישומים של טכניקה זו.
לפני להתעמק בשיטות, בואו נעבור על כמה עקרונות בסיסיים. Explants ניתן להקים ממספר אורגניזמים מודל ומגוון של סוגי רקמות. בדרך כלל, התרבויות נוצרות על ידי הסרת רקמות עצביות בזהירות מעובר, ניתוח אזור של עניין, והכנסתו לסביבה מלאכותית.
ניתן גם לחלק רקמות לסדינים דקים ולגדל ב"תרבות פרוסות". מכיוון שסביבת התרבות נועדה לחקות את תנאי ה- in vivo של האיבר כולו, אסטרטגיית תרבות זו נקראת לעתים קרובות "organotypic".
לפני תחילת העבודה, הקפד לחטא את המכשירים שלך עם 70% אתנול. לאחר מכן, המתת חסד עכבר בהריון באמצעות השיטה המועדפת על המעבדה שלך. לאחר מכן, בניתוח excise הרחם ומניחים חוצץ קר כקרח. מעבירים את המנה למיקרוסקופ ניתוח ומסירים עוברים בודדים מפק החלמון שלהם. לאחר מכן, בודדו את המוח, ניתחו בקפידה את אזור העניין שלכם, והעבירו לצלחת תרבות המכילה מדיום תרבותי. Explants ניתן לשמור בחממה 37 °C המכיל 5% CO2 במשך כמה שבועות על ידי החלפת 50% של המדיום כל 2 - 3 ימים.
תרבית פרוסה של רקמת המוח דורשת כמה צעדים נוספים. לפני החתך, הרקמה מוטבעת באגרוז, המספק תמיכה לרקמה כך שהיא נשארת שלמה בזמן שהיא פרוסה. כדי לעשות זאת, 1.5% נקודת התכה נמוכה אגורוז פתרון מחומם עד אגרוז מתמוסס. לאחר מכן, האגורוז מועבר להטמעת תבניות ומותר להתקרר מעט כדי למנוע פגיעה ברקמה.
לאחר מכן ניתן לשקוע בזהירות את הרקמה ואת האגרוז שנותר להקשיח. הבלוקים המתקבלים נחתכים ואז מודבקים לשלב דגימה ומחולקים באמצעות ויברטום, שהוא מכשיר המשתמש בלהב רוטט כדי לחתוך פרוסות דקות של רקמה חיה. כפי פרוסות נוצרות, הם מועברים בקפידה לצלחת מצופה המכילה מדיה תרבותית ותרבות כאמור.
ישנם מספר יתרונות לשימוש בתרבויות explant על פני vivo ושיטות במבחנה אחרות. ראשית, תאים ברקמה המוסברת נגישים יותר לכלים ניסיוניים. שנית, העובדה כי explants לשמור על הארכיטקטורה התאית המורכבת של פיתוח רקמה עצבית אומר כי אינטראקציות תא תא ניתן ללמוד. שלישית, שכן הם יכולים לשלוט על ההרכב הכימי של המדיום התרבותי, מדענים יכולים להשתמש explants כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות ספציפיות על התפתחות הרקמות.
עם זאת, מאז הוא מוסר מהסביבה הטבעית שלה, יש לנקוט טיפול מיוחד כדי לשמור על רקמות מאושרות ובריאות במבחנה. לדוגמה, נוכחות של מטריצה חוץ תאית, או ECM, יש השפעה משמעותית על התנהגות התא, כך חלבוני ECM מטוהרים משמשים לעתים קרובות כדי לצפות מנות תרבות. שיקול חשוב נוסף הוא הפתרון שבו הרחצה של המסלקים. בעוד מדיה מסורתית של תרבית תאים משמשת לעתים קרובות, ניסויים מסוימים דורשים פתרונות הדומים מאוד לנוזל המסתובב במערכת העצבים המרכזית: הנוזל השדרתי, שהוא ריאגנט קריטי בניסויים כמו אלה שאתה עומד לראות.
עכשיו שעברנו על שיטות תרבות מסבירות, בואו נראה איך משתמשים בטכניקות האלה.
נדידת תאים משתמשת ברקמה מוסברת כדי לבחון את האותות הדוחים והאטרקטיביים המעורבים בתנועת תאים עצביים. בניסוי זה, חרוזים שהיו ספוגים בעבר בגורמי גדילה מושתלים לתוך explants אחורי כדי לבחון את נדידת התא העצבי. לאחר 3 - 4 ימים של חשיפה, נוירונים צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. התוצאות מראות כי נוירונים מוטוריים נודדים לכיוון חרוזים ספוגים בגורם גדילה אנדותל וסקולרי, אך לא חרוזי בקרה ספוגים במאגר.
תידות שיתוף משמשות לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות תא תא במהלך הפיתוח. בדוגמה זו, מקטעים של חוט השדרה היו בתרבית על גבי שכבה של תאי שריר כדי לחקור כיצד נוצרים קשרים בין נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה ושריר השלד. כבר יומיים לאחר הדגירה, תחזיות מהנוירונים, הידועים גם בשם neurites, נראים מגיחים מן explant. בתוך 5 ימים, innervation פונקציונלי הוא ציין על ידי התכווצות של שכבת תא השריר.
במהלך התפתחות מערכת העצבים, נוירונים חייבים להאריך את האקסונים שלהם כדי ליצור קשר בין רקמת היעד לבין מערכת העצבים המרכזית. דרך אחת ללמוד את התהליך המורכב הזה היא באמצעות בחינות הדרכה אקסון. חוקרים משתמשים ברקמות מוסברות כדי לבחון את הגורמים בתוך הנוירונים ובסביבה שמסביב המסייעים להנחות את האקסון למיקומו הנכון.
הרגע צפית במדריך של JoVE לתרבות מסבירה של רקמה עצבית. סרטון זה כיסה סקירה כללית של היתרונות של תרבויות explant, אסטרטגיות תרבות, פרוטוקולים שלב אחר שלב של שני הליכי explant נפוץ ודרכים טכניקות אלה משמשים במעבדה היום.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
