Overview
L'intricata struttura del sistema nervoso dei vertebrati deriva da una complessa serie di eventi che coinvolgono la differenziazione cellulare, la migrazione cellulare e i cambiamenti nella morfologia cellulare. Studiare questi processi è essenziale per la nostra comprensione della funzione del sistema nervoso e per la nostra capacità di diagnosticare e trattare i disturbi che derivano da uno sviluppo anormale. Tuttavia, i tessuti neurali sono relativamente inaccessibili per le manipolazioni sperimentali, specialmente nei mammiferi embrionali. Di conseguenza, molti scienziati sfruttano la coltura di espianto per studiare i processi di sviluppo neurologico in un ambiente "organotipico", il che significa che il tessuto viene rimosso dall'organismo ma la sua complessa architettura cellulare viene mantenuta. Generalmente, le colture di espianto vengono create da un'attenta dissezione del tessuto neurale che viene poi immerso in mezzi di crescita attentamente progettati e coltivato in vitro.
Questo video fornirà innanzitutto una breve panoramica della coltura di espianto neurale, compresi i suoi vantaggi rispetto ad altri metodi in vitro e importanti considerazioni per il mantenimento di tessuti sani. Successivamente, verrà fornito un protocollo generale per la creazione di una coltura di espianto dal cervello embrionale del topo, delineando l'isolamento degli embrioni dalla madre e la dissezione del cervello. La presentazione include anche una panoramica della coltura a fette, in cui vengono generate sezioni sottili di tessuto del sistema nervoso per un migliore accesso visivo alle cellule in via di sviluppo. Infine, verranno fornite alcune applicazioni di queste tecniche per dimostrare come possono essere utilizzate per rispondere a domande importanti nel campo dello sviluppo neurologico.
Procedure
Le colture di espianto servono come tecnica per studiare lo sviluppo di specifiche popolazioni cellulari e strutture neurali. Negli esperimenti di neuroscienze dello sviluppo, gli espianti sono tessuti neurali asportati da un embrione per lo sviluppo continuo in vitro. Queste colture danno ai ricercatori la capacità di manipolare e visualizzare i tessuti in via di sviluppo in modi che non sono possibili in vivo. Questo video introdurrà alcuni importanti principi alla base del lavoro con tessuti espiantati, procedure passo-passo per due approcci alla coltura di espianto, nonché applicazioni di questa tecnica.
Prima di approfondire i metodi, esaminiamo alcuni principi di base. Gli espianti possono essere stabiliti da un numero di organismi modello e da una varietà di tipi di tessuto. Generalmente, le colture vengono create rimuovendo con cura il tessuto neurale da un embrione, sezionando una regione di interesse e collocandola in un ambiente artificiale.
I tessuti possono anche essere sezionati in fogli sottili e coltivati in "slice culture". Poiché l'ambiente di coltura è progettato per imitare le condizioni in vivo dell'intero organo, questa strategia di coltura è spesso chiamata "organotipica".
Prima di iniziare, assicurati di sterilizzare i tuoi strumenti con il 70% di etanolo. Successivamente, l'eutanasia di un topo in gravidanza utilizzando il metodo preferito dal laboratorio. Quindi, asportare chirurgicamente l'utero e metterlo in un tampone ghiacciato. Trasferire il piatto su un microscopio di dissezione e rimuovere i singoli embrioni dal loro sacco vitellino. Quindi, isolare il cervello, sezionare attentamente la regione di interesse e trasferirsi in un piatto di cultura contenente terreno di coltura. Gli espianti possono essere mantenuti in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO2 per alcune settimane sostituendo il 50% del mezzo ogni 2 - 3 giorni.
La coltura a fette di tessuto cerebrale richiede alcuni passaggi extra. Prima del sezionamento, il tessuto è incorporato nell'agarose, che fornisce supporto al tessuto in modo che rimanga intatto mentre viene affettato. Per fare questo, una soluzione di agarose a basso punto di fusione all'1,5% viene riscaldata fino a quando l'agarose si dissolve. Successivamente, l'agarose viene trasferito agli stampi incorporanti e lasciato raffreddare leggermente per evitare di danneggiare il tessuto.
Il tessuto può quindi essere accuratamente immerso e l'agarose lasciato indurire. I blocchi risultanti vengono tagliati e poi incollati a uno stadio campione e sezionati utilizzando un vibratoma, che è uno strumento che utilizza una lama vibrante per tagliare sottili fette di tessuto vivente. Man mano che le fette vengono generate, vengono accuratamente trasferite in un piatto rivestito contenente mezzi di coltura e coltivate come accennato in precedenza.
Ci sono una serie di vantaggi nell'utilizzare colture di espianto rispetto a in vivo e altri metodi in vitro. In primo luogo, le cellule nel tessuto espiantato sono più accessibili agli strumenti sperimentali. In secondo luogo, il fatto che gli espianti mantengano la complessa architettura cellulare dello sviluppo del tessuto neurale significa che le interazioni cellula-cellula possono essere studiate. In terzo luogo, poiché possono controllare la composizione chimica del terreno di coltura, gli scienziati possono utilizzare gli espianti per testare l'effetto di composti specifici sullo sviluppo dei tessuti.
Tuttavia, poiché viene rimosso dal suo ambiente naturale, è necessario prestare particolare attenzione per mantenere il tessuto felice e sano in vitro. Ad esempio, la presenza di matrice extracellulare, o ECM, ha un impatto significativo sul comportamento cellulare, quindi le proteine ECM purificate vengono spesso utilizzate per rivestire i piatti di coltura. Un'altra considerazione importante è la soluzione in cui vengono bagnati gli espianti. Mentre i tradizionali mezzi di coltura cellulare sono spesso usati, alcuni esperimenti richiedono soluzioni che assomigliano molto al fluido che circola nel sistema nervoso centrale: il liquido cerebrospinale, che è un reagente critico in esperimenti come quelli che stai per vedere.
Ora che abbiamo esaminato i metodi di coltura di espianto, vediamo come vengono utilizzate queste tecniche.
I saggi di migrazione cellulare utilizzano il tessuto espiantato per esaminare i segnali ripugnanti e attraenti coinvolti nel movimento delle cellule neurali. In questo esperimento, le pere che sono state precedentemente immerse in fattori di crescita vengono impiantate in espianti di cervello posteriore per esaminare la migrazione delle cellule neurali. Dopo 3 - 4 giorni di esposizione, i neuroni sono stati ripresi utilizzando un microscopio confocale. I risultati mostrano che i motoneuroni migrano verso perle imbevute di fattore di crescita endoteliale vascolare, ma non controllano le perle imbevute di tampone.
I saggi di co-coltura sono spesso utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula durante lo sviluppo. In questo esempio, segmenti di midollo spinale sono stati coltivati sopra uno strato di cellule muscolari per studiare come vengono fatte le connessioni tra i motoneuroni spinali e il muscolo scheletrico. Già 2 giorni dopo l'incubazione, le proiezioni dei neuroni, noti anche come neuriti, sono viste emergere dall'espianto. Entro 5 giorni, l'innervazione funzionale viene osservata dalla contrazione dello strato di cellule muscolari.
Durante lo sviluppo del sistema nervoso, i neuroni devono allungare i loro assoni per stabilire una connessione tra il tessuto bersaglio e il sistema nervoso centrale. Un modo per studiare questo complesso processo è attraverso saggi di guida assonale. I ricercatori usano tessuti espiantati per esaminare i fattori all'interno dei neuroni e nell'ambiente circostante che aiutano a guidare l'assone nella sua posizione corretta.
Hai appena visto la guida di JoVE per espiantare la coltura del tessuto neurale. Questo video ha coperto una panoramica dei vantaggi delle colture di espianto, strategie di coltura, protocolli passo-passo di due procedure di espianto comunemente usate e modi in cui queste tecniche vengono utilizzate oggi in laboratorio.
Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
