Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse In Situ Utilizzo del metodo TUNEL

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le rotture del DNA e la morte cellulare nel C due. Ciò si ottiene mediante la prima permeazione delle sezioni di tessuto per consentire ai reagenti del tunnel di entrare nel nucleo cellulare. Successivamente, l'enzima TDT viene utilizzato per legare in modo covalente i DTP a tre estremità primarie delle rotture del DNA in queste cellule.

Quindi il DUTP viene etichettato con una sonda fluorescente. In definitiva, il segnale positivo del tunnel viene quantificato in sezioni di tessuto che riflettono la frequenza relativa delle rotture del DNA nelle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il southern blotting o l'immunoistochimica, è che è relativamente veloce, specifica e fornisce un modo per eliminare il rumore e l'autofluorescenza.

Inizia fissando gli arti posteriori isolati al 4% di para formaldeide in PBS in un tubo da 15 millilitri e lascia che la fissazione vada da quattro a un massimo di 24 ore a quattro gradi Celsius. Sono necessarie solo due ore se il tessuto è embrionale. Tuttavia, dopo la fissazione, sostituire la soluzione con il 10% di saccarosio per crioproteggere il tessuto e incubarla durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, cambiare la soluzione con saccarosio filtrato sterile al 30% e continuare l'incubazione durante la notte o fino a quando gli arti posteriori non affondano sul fondo della provetta. Durante l'incorporazione, è importante che gli arti posteriori siano completamente immersi nel mezzo di inclusione. Gli stampi per l'inclusione possono essere posizionati direttamente su ghiaccio secco o in isop pentano su ghiaccio secco per congelare il terreno.

Durante la criosezione. I blocchi tagliano sezioni di trasferimento spesse 10 micron o più sottili, le sezioni più spesse non saranno penetrate dai reagenti di marcatura del tunnel. Raccogliere queste sezioni sottili su vetrini rivestiti di gelatina o legante vettoriale a temperatura ambiente.

Molto rapidamente, trasferire i vetrini sul ghiaccio secco per la conservazione. Per prima cosa scongelare un vetrino di sezione di tessuto congelato a temperatura ambiente e lasciarlo asciugare per 16-64 ore. Una volta che il vetrino è a temperatura ambiente, reidratare la sezione in un barattolo di accoppiamento riempito di PBS per 10 minuti.

Ripetere questa fase di reidratazione una volta, quindi asciugare accuratamente il vetrino con una salvietta da laboratorio senza disturbare la sezione di tessuto per permeare la sezione, posizionare il vetrino in una camera di umidità e pipettare 50 microlitri di reagenti commerciali a base di saponina non proteolitica sulla sezione. Non pipettare direttamente sulle sezioni in quanto potrebbe staccarsi o danneggiarsi. Quindi posizionare un piccolo pezzo di parapellicola sulla sezione per stendere il reagente.

Se si formano delle bolle, riapplicare la pellicola para. Lasciare incubare il vetrino per un'ora dopo un'ora. Rimuovere i reagenti con due lavaggi di cinque minuti in PBS e asciugarli accuratamente.

Accanto all'etichetta DNA si rompe con TDT, utilizzare un kit disponibile in commercio. Innanzitutto, creare un tampone XTDT e pipettarlo sulla sezione. Quindi incubare il vetrino per cinque minuti nella camera di umidificazione.

In secondo luogo, preparare una miscela di etichettatura TDT secondo le istruzioni del kit o un vetrino di controllo positivo. Aggiungi il DNA al mix di etichettatura TDT. Per un vetrino di controllo negativo, omettere l'enzima TDT dalla miscela.

A questo punto, con una salvietta, rimuovere la maggior quantità possibile di tampone dal vetrino e pipettarlo sulla miscela per etichette. 50 microlitri dovrebbero essere sufficienti. Anche in questo caso, spalmare la soluzione con paraform senza formare bolle.

Lasciare incubare il vetrino nella camera per un'ora a 37 gradi Celsius. Terzo, crea il buffer one x stop secondo le istruzioni del kit. Dopo aver rimosso la miscela per l'etichettatura con la salvietta da laboratorio, aggiungere da due a 300 microlitri della miscela di arresto per coprire completamente la sezione.

Quindi incubare il vetrino per cinque minuti nella camera. In questa fase non viene utilizzato alcun film para. Per rimuovere il tampone di arresto, utilizzare due lavaggi di due minuti in PBS.

Ora pipettare 50 microlitri di soluzione di etichettatura con fluoresceina appena preparata. Sul vetrino, applicare il perfil e incubare per 20 minuti nella camera, ma questa volta al buio. Rimuovere la soluzione di etichettatura con un unico lavaggio di due minuti in PBS mentre il lavaggio diluisce alcuni ganci.

3, 3, 2, 5, 8 a un microgrammo per millilitro in PBS. Dopo i lavaggi, coprire le sezioni con uno o 200 microlitri della soluzione di ganci diluiti. Quindi incubare il vetrino per cinque minuti, al riparo dalla luce per rimuovere i ganci da macchiare, utilizzare tre lavaggi da cinque minuti in PBS.

Quindi asciugare accuratamente il vetrino con una salvietta da laboratorio e applicare un vetrino coprioggetti per l'imaging. Fotografa la sezione utilizzando i filtri dpi, fitzy e Texas red per separare la macchia dei ganci, la macchia del tunnel e i segnali di autofluorescenza in tre canali di falsi colori in un'unica immagine. Standardizza e mantieni le stesse impostazioni di imaging tra tutti i vetrini in modo che possano essere facilmente confrontati.

Non utilizzare alcuna impostazione automatica di esposizione o guadagno per riferimento anatomico. Utilizzare un'immagine luminosa in campo chiaro di una sezione adiacente dell'arto posteriore colorata con h ed e nel software di analisi delle immagini. Chiudere il canale del tunnel.

Successivamente tracciare manualmente il contorno dell'area muscolare da quantificare utilizzando gli altri canali. Converti l'area tracciata in una maschera. Quindi riattivare il canale tunnel e regolare la soglia minima di intensità per escludere il segnale autofluorescente.

Utilizzare lo stesso limite di soglia su tutte le sezioni analizzate nello studio. Quindi, converti i pixel di soglia in una maschera. In ogni immagine, combina la maschera dell'area muscolare e la maschera del tunnel di soglia.

Questo crea una rappresentazione del segnale del tunnel all'interno dell'area muscolare tracciata. Ora quantifica la maschera combinata per determinare il numero di oggetti positivi del tunnel e l'area totale dei pixel del segnale del tunnel all'interno del muscolo. Utilizzare questi valori per l'analisi statistica.

Gli oggetti positivi al tunnel che a basso ingrandimento possono apparire come frammenti irregolari luminosi nel muscolo scheletrico. Tuttavia, a un ingrandimento più elevato, alcuni oggetti tunnel positivi con la classica morfologia apoptotica dovrebbero essere osservati se il tipo di morte cellulare coinvolgesse questa apoptosi. Il controllo positivo con l'aggiunta di D DNA dovrebbe mostrare un abbondante segnale positivo del tunnel distribuito uniformemente su tutti i tessuti.

Nella sezione. Il controllo negativo senza l'enzima TDT dovrebbe avere un fondo di bassa intensità e mostrare solo autofluorescenza. Con il protocollo descritto, è stato riscontrato che le cellule ossee ed endoteliali dei globuli rossi hanno contribuito al segnale autofluorescente nelle sezioni degli arti superiori preparate.

Il vero segnale positivo del tunnel era molto più intenso. Potrebbe essere isolato dal segnale autofluorescente utilizzando una soglia di intensità dei pixel. Un'altra opzione per isolare il segnale del tunnel era quella di sottrarre digitalmente il canale rosso di autofluorescenza dal canale del tunnel.

Utilizzando questa tecnica, morte delle cellule muscolari scheletriche. In un modello murino di SMA è stato valutato, la marcatura del tunnel ha rivelato più cellule apoptotiche nei topi SMA di cinque giorni rispetto ai controlli. Quantificando la colorazione del tunnel, questa osservazione ha dimostrato di essere statisticamente significativa per più gruppi muscolari all'interno dell'arto posteriore.

Una volta padroneggiata, la tecnica del tunnel può essere eseguita in circa quattro ore per generare risultati quantitativi affidabili.