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Uma introdução à biologia das células-tronco
 
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Uma introdução à biologia das células-tronco

Overview

Células que podem se diferenciar em uma variedade de tipos de células, conhecidas como células-tronco, estão no centro de um dos campos mais emocionantes da ciência hoje. Biólogos de células-tronco estão trabalhando para entender os mecanismos básicos que regulam como essas células funcionam. Esses pesquisadores também estão interessados em aproveitar o notável potencial das células-tronco para tratar doenças humanas.

Aqui, o JoVE apresenta uma introdução ao cativante mundo da biologia das células-tronco. Começamos com uma linha do tempo de estudos de referência, desde as primeiras evidências experimentais para células-tronco hematopoiéticas na década de 1960, até avanços mais recentes, como células-tronco pluripotentes induzidas. Em seguida, são introduzidas questões-chave sobre biologia de células-tronco, por exemplo: Como essas células mantêm sua capacidade única de se submeter à auto-renovação? Isso é seguido por uma discussão de alguns métodos proeminentes utilizados para responder a essas perguntas. Finalmente, vários experimentos são apresentados para demonstrar o uso de células-tronco na medicina regenerativa.

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Como o nome indica, as células-tronco são os precursores dos quais muitos tipos de células diferentes "nascem". Eles são caracterizados por sua potência, ou capacidade de diferenciar-se em células das três camadas germinativas, bem como sua renovabilidade, ou capacidade de gerar mais células-tronco. Na esperança de avançar nos campos da biologia do desenvolvimento e da medicina regenerativa, pesquisadores de células-tronco estão trabalhando para entender como essas células únicas realizam um feito tão importante.

Este vídeo abrange grandes descobertas no campo da biologia de células-tronco, perguntas-chave feitas por cientistas neste campo, métodos proeminentes usados por pesquisadores de células-tronco e aplicações de pesquisas com células-tronco.

Agora que introduzimos o conceito de células-tronco, vamos mergulhar na rica história da pesquisa de células-tronco.

Na década de 1960, os Drs. Ernest McCulloch e James Till descobriram algumas das primeiras evidências definitivas para a existência de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea de mamíferos adultos. Essas células têm a capacidade de se auto-renovar e são multipotentes, o que significa que podem se diferenciar em múltiplos, mas limitados, tipos de células - ou seja, as células do sangue e dos sistemas imunológicos.

Em 1988, Irving Weissman e colegas aperfeiçoaram um método de purificação de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea do rato.

Em 1981, a professora Gail Martin cunhou o termo "célula-tronco embrionária". Ao contrário das células-tronco hematopoiéticas, as células-tronco embrionárias são pluripotentes, tendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos celulares do corpo. Ela e os cientistas Martin Evans e Matthew Kaufman, simultaneamente, mas separadamente, desenvolveram métodos para extrair a massa celular interna dos blastocistos de camundongos e cultuá-los in vitro como células-tronco.

Em 1998, mais de dez anos após o isolamento de células-tronco embrionárias de camundongos, o Dr. James Thomson estabeleceu com sucesso as primeiras linhas de células-tronco embrionárias humanas.

Em 2006, um grande avanço ocorreu com o advento de células-tronco pluripotentes induzidas, como idealizado pelo Dr. Shinya Yamanaka. Com base no trabalho de John Gurdon, Yamanaka desenvolveu um método para reprogramar células diferenciadas para um estado pluripotente usando retrovírus para induzir a expressão de um pequeno conjunto de fatores de transcrição agora conhecidos como "fatores Yamanaka". As células resultantes foram denominadas "células-tronco pluripotentes induzidas", ou "iPSCs". Esses experimentos foram considerados tão fundamentalmente importantes que Yamanaka e Gurdon foram premiados com o Prêmio Nobel em 2012.

Atualmente, temos agora modelos iPSC de várias doenças humanas, e plataformas de regeneração em múltiplos tecidos.

Hoje, a pesquisa de células-tronco é impulsionada por várias questões abrangentes.

Uma das questões mais importantes é: como as células-tronco mantêm a pluripotência e a renovabilidade? Existem duas características relacionadas de células-tronco que conferem essas propriedades. Primeiro é a expressão de genes específicos essenciais para a caule e auto-renovação. A segunda é a responsividade das células-tronco a fatores regulatórios que afetam a expressão desses genes.

A próxima pergunta lógica é: como é direcionada a diferenciação de células-tronco? À medida que uma célula-tronco se desenvolve em uma célula madura, a ativação de vias específicas de diferenciação induz mudanças na expressão genética, desligando genes de células-tronco e ativando genes específicos do tecido, o que resulta em especialização crescente da função celular e da morfologia.

Finalmente, vamos abordar a questão principal que impulsiona o financiamento da pesquisa de células-tronco: as células-tronco podem ser usadas para tratar doenças? A medicina regenerativa está abordando essa questão de duas formas: 1) por regrou órgãos em laboratório, e 2) através do parto de células-tronco via transplante para tratar a degeneração tecidual.

Agora que apresentamos algumas das principais questões sobre biologia de células-tronco, vamos passar por cima de alguns dos métodos proeminentes usados para enfrentá-los.

A tecnologia de microarray pode ser empregada para descobrir quais genes conferem potência e renovabilidade nas células-tronco. Nesta técnica, o RNA total é isolado de uma população de células, que atua como um instantâneo da expressão genética atual. Em uma série de etapas, este mRNA é convertido em uma sonda fluorescentemente rotulada e hibridizado para um chip contendo transcrições de todo o genoma humano. A varredura deste chip fornece uma leitura de perfis relativos de expressão genética. Como você pode ver, uma célula-tronco expressa um conjunto específico de genes que difere de uma célula diferenciada.

Outro ensaio para genes de pluripotência envolve o sistema de detecção Oct4-GFP. Oct4 é necessário para auto-renovação, e é rapidamente regulado durante a diferenciação. Portanto, sua expressão age como um indicador confiável de "stemness". Neste experimento, as células expressam proteína fluorescente verde sob o controle do promotor de Oct4. Essas células podem então ser manipuladas experimentalmente, e mudanças na expressão GFP são analisadas para identificar novos genes ou fatores solúveis que modulam a autoconexão.

Para estudar células-tronco in vitro,devemos primeiro entender como cultuá-las. As células-tronco requerem um microambiente específico para manter a haste. Isso pode ser conseguido através da co-cultivo de células-tronco com células alimentador, como fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs. Os MEFs secretam uma mistura complexa de fatores necessários de pluripotência e auto-renovação.

Às vezes, é desejável ter culturas livres de alimentadores de células-tronco. O principal método para manter as linhas celulares livres de alimentadores é complementar a mídia de cultura celular com reagentes de estoque de fatores de crescimento e inibidores.

Diferenciar células-tronco in vitro é realizado usando vários métodos. A expressão genética diferencial é, em última análise, responsável pela especialização das células. No método de duas etapas que você vê aqui, células-tronco embrionárias de camundongos são preparadas para um destino neuronal antes de serem ainda mais diferenciadas com o meio de indução do neurônio motor. Esses fatores ativam caminhos específicos da expressão genética, resultando em alterações morfológicas e proteômicas características dos neurônios motores.

Uma grande desvantagem da diferenciação in vitro tradicional é que as placas planas restringem o crescimento 3D das células. O método de queda suspensa e os métodos de microcápsula contornam essas questões. Na técnica de queda suspensa, pequenas gotas de suspensões de células-tronco são banhadas na tampa de uma placa de petri e cultivadas de cabeça para baixo para formar agregados de células-tronco conhecidas como corpos embrióides.

Nos métodos de microencapsulação, as células-tronco são misturadas com uma membrana semipermeável biocompatível chamada alginato, e depositadas como contas em placas de cultura celular. Ambos os métodos permitem maior diferenciação em células especializadas, como neurônios dopaminérgicos e cardiomiócitos.

Saber como direcionar a diferenciação é um grande passo para o uso de células-tronco na medicina regenerativa. A terapia de transplante de células-tronco visa tratar e curar doenças degenerativas, reparando tecidos danificados com células-tronco. Neste experimento, as células somáticas dos pacientes são reprogramadas em células iPS através de infecção lentivral dos fatores yamanaka. A partir de seu estado pluripotente, as células são diferenciadas em tipos de células específicas e devolvidas ao hospedeiro para reparar tecido danificado.

Agora que você conhece alguns dos métodos usados para investigar células-tronco, vamos dar uma olhada em como esses métodos são aplicados em experimentos específicos.

Neste experimento usando um modelo de camundongo de esclerose múltipla, células-tronco neurais são injetadas por via intravenosa em camundongos afetados. Fatias cerebrais de camundongos tratados são coletadas e imagens sob um microscópio para avaliar o sucesso do transplante. Células derivadas de células precursoras neuronais doadoras são rastreadas usando o gene repórter LacZ. Como você pode ver, uma série de células-tronco doadoras se diferenciaram e se integraram ao sistema nervoso central de camundongos doentes.

Nem todas as doenças podem ser tratadas por injeções sistêmicas. Lesões de cartilagem, por exemplo, requerem um andaime especializado para reconstruir ao redor. Neste experimento, uma mistura de células-tronco mesenquimais e fatores de coagulação são cultivadas juntas para formar um coágulo. O coágulo é então colocado na cartilagem do joelho danificada de um coelho e permitido a integração. Após este procedimento, pode-se observar a remodelação da cartilagem do joelho para uma articulação lisa e funcional.

Às vezes, pesquisadores de células-tronco e engenheiros de tecidos se unem para reconstruir órgãos inteiros. Neste experimento, os pulmões primatas são lavados para descelularizar o órgão, deixando para trás apenas componentes estruturais não celulares. Este pulmão "fantasma" é então transferido para um bioreator, onde é semeado com células-tronco vasculares e epiteliais. Para imitar ainda mais a pressão e o comportamento que um pulmão natural experimenta, o bioreator circula mídia, mantém os níveis de pressão e gás, e infla os pulmões.

Você acabou de ver a visão geral da biologia das células-tronco do JoVE. Para recapitular, neste vídeo discutimos células-tronco e seu histórico, métodos de manutenção, diferenciação e entrega e aplicações de células-tronco. Obrigado por assistir!

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