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Developmental Biology

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Overview

La mappatura del destino è una tecnica utilizzata per capire come le cellule embrionali si dividono, si differenziano e migrano durante lo sviluppo. Nei classici esperimenti di mappatura del destino, le cellule in diverse aree di un embrione vengono etichettate con un colorante chimico e quindi tracciate per determinare quali tessuti o strutture formano. I miglioramenti tecnologici consentono ora di marcare e tracciare le singole cellule durante lo sviluppo embrionale e l'età adulta.

Questo video esamina i concetti alla base della mappatura del destino e quindi descrive in dettaglio un protocollo di mappatura del destino nel pesce zebra utilizzando proteine fluorescenti fotoattivabili. Infine, vengono discusse le applicazioni specifiche e le modifiche di questa tecnica unica.

Procedure

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I biologi dello sviluppo usano la mappatura del destino come strumento per tracciare i lignaggi cellulari mentre un organismo matura. Questo viene fatto etichettando le cellule in una fase embrionale e quindi monitorando loro e la loro progenie durante lo sviluppo dell'organismo. La mappatura del destino viene anche utilizzata per studiare la migrazione e la differenziazione cellulare durante lo sviluppo, nonché la rigenerazione e la riparazione durante l'età adulta.

Questo video fornirà una panoramica della mappatura del destino, spiegherà un protocollo utilizzato per generare una mappa del destino nel pesce zebra e mostrerà alcuni modi in cui questa tecnica viene attualmente applicata nei laboratori.

Prima di saltare nei dettagli procedurali, discutiamo cos'è una mappa del destino e come è costruita.

Nei classici esperimenti di mappatura del destino, gli scienziati hanno colorato gruppi di cellule in un embrione precoce, come quelli nello stadio di gastrula, con un colorante che sarebbe stato trasmesso a tutti i discendenti di queste cellule. Dopo aver permesso all'embrione di svilupparsi per un certo periodo di tempo, hanno visto le cellule colorate nell'organismo più maturo. È stata quindi notata la posizione delle cellule colorate nell'organismo maturo. I risultati in comune di diversi esperimenti simili hanno permesso la costruzione di un diagramma noto come mappa del destino.

Pertanto, una mappa del destino è un piano generale che delinea il destino di ogni parte di un embrione precoce. Queste mappe aiutano gli scienziati a determinare cose come quali cellule embrionali si differenziano in quali cellule adulte funzionali e come migrano e si organizzano in strutture mature.

Gli scienziati hanno utilizzato molti organismi modello per creare mappe del destino, tra cui rane, nematodi, pesci, pulcini e topi. Alcuni organismi modello, come il pesce zebra Danio rerio, hanno un ulteriore vantaggio in questo tipo di esperimento. Poiché sono piccoli e rimangono trasparenti per gran parte del processo di sviluppo, gli scienziati possono facilmente tracciare le cellule osservando il pesce al microscopio ottico. È importante sottolineare che i progressi nelle tecniche di etichettatura cellulare ora consentono agli scienziati di contrassegnare con precisione le singole cellule e rintracciarle mentre l'organismo si sviluppa, il che aiuta nella creazione di una mappa del destino estremamente dettagliata.

Ora che hai un'idea di cosa siano le mappe del destino, discutiamo di un protocollo per la mappatura del destino nel pesce zebra che utilizza la fotoattivazione. Questo approccio relativamente nuovo dipende dalle proteine fotoattivabili. Si tratta di speciali proteine fluorescenti, che sono "ingabbiati", il che significa che sono tenute in una conformazione specifica per prevenire la fluorescenza. Un'applicazione di un impulso laser controllato provoca un cambiamento conformazionale, denominato "uncaging", che si traduce in fluorescenza visibile.

Per eseguire questo esperimento, queste proteine in gabbia specializzate vengono prima sintetizzate e poi iniettate in embrioni di zebrafish a uno o due stadi cellulari. Successivamente, gli embrioni sono autorizzati a maturare allo stadio di sviluppo desiderato prima della fotoattivazione.

Quindi, per preparare il pesce alla fotoattivazione, gli embrioni vengono decorionati per rendere accessibile il tessuto bersaglio. Successivamente, sono montati in un mezzo otticamente chiaro, come l'agarose a bassa temperatura di fusione, che li mantiene in modo sicuro in una posizione stabile. I campioni sono allineati per esporre l'area di interesse e montati su un microscopio dotato di laser. Un impulso laser viene applicato all'area mirata contenente cellule di interesse, inducendo la fotoattivazione.

Dopo il trattamento laser, gli embrioni vengono accuratamente rimossi dall'agarose e restituiti al loro ambiente naturale fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Al fine di tracciare le cellule fotoattivate, gli embrioni sono di nuovo incorporati nell'agarose a bassa temperatura di fusione e le cellule fotoattivate possono quindi essere visualizzate e tracciate utilizzando la fluorescenza diretta o l'immuno colorazione.

Ora che hai una comprensione generale di un protocollo di mappatura del destino, diamo un'occhiata ad alcuni esperimenti di laboratorio che sfruttano questa procedura.

Oltre a studiare lo sviluppo embrionale, la mappatura del destino può essere utilizzata per esaminare la riparazione nei sistemi maturi. In questo esperimento, un sottotipo di cellula specifico è stato ablato da una retina transgenica di zebrafish. Gli scienziati hanno quindi rintracciato cellule staminali adulte residenti geneticamente etichettate per determinare il loro destino a seguito di lesioni. Infine, è stata eseguita l'analisi delle immagini, che ha dimostrato l'attivazione delle cellule staminali adulte e la successiva riparazione dei tessuti.

Gli scienziati stanno anche usando protocolli simili per capire il destino delle cellule staminali trapiantate. Qui, le cellule staminali embrionali umane geneticamente marcate, o hESC, sono state trapiantate in un modello murino immunocompromesso. Le cellule impiantate sono state lasciate differenziare per 8-12 settimane, dopo di che il teratoma risultante, che è un tumore che contiene tessuto da più strati germinali, è stato raccolto, fissato e immunomaccato per determinare il destino delle cellule staminali impiantate. Questo tipo di esperimento aiuta gli scienziati a confermare il potenziale differenziativo in vivo delle cellule staminali coltivate.

Come accennato in precedenza, gli scienziati eseguono procedure di mappatura del destino in vari organismi modello, compresi i mammiferi. In questo particolare studio, gli scienziati hanno contrassegnato le cellule in una regione specifica di un embrione di topo precoce utilizzando approcci genetici inducibili. Questo viene fatto somministrando un agente induttore a un topo gravido che trasporta prole geneticamente modificata. Le cellule etichettate sono state monitorate durante le fasi successive dello sviluppo, il che ha aiutato gli scienziati a determinare il loro destino finale.

Hai appena visto il video di JoVE sulla mappatura del destino. Questo video ha fornito alcune informazioni sulla creazione di mappe del destino, ha esaminato uno specifico protocollo di mappatura del destino e ha discusso alcune delle modifiche e delle applicazioni di questa tecnica estremamente utile. Come sempre, grazie per aver guardato!

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