ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製
March 31st, 2017
ここで説明されているのは、長期のゲノムシーケンシングに使用するための、偏在する生物栄養性真菌病原体であるうどんこ病からのゲノムDNAの抽出、精製、および品質管理の方法です。
このプロトコルの全体的な目標は、うどんこ病一倍体分生子から高分子量ゲノムDNAを単離し、ロングリードゲノムシーケンシングを行うことです。この方法は、研究が困難なゲノムの構造や組成など、植物病原性真菌生物学分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、取り扱いが困難な病原体から高品質のゲノムDNAを抽出できることです。
実験を開始するには、分生子クライオバイアルから磁石で鋼球をすばやく取り除きます。700マイクロリットルの65°C溶解バッファーを加え、溶液を5〜10秒間ボルテックスします。5〜10秒後、スラリーが形成されます。
300マイクロリットルの65度を予め温めた5体積のサルコシルを加え、それを5回静かに反転させます。チューブを摂氏65度で30分間インキュベートします。ワイドボアピペットチップを使用して、溶液全体を新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
1容量のクロロホルムイソアミルアルコールを溶解液に加え、チューブを静かに反転させて5回混合します。混合物を室温で10分間インキュベートします。チューブを静かに反転させて、中間点で5回混合し、インキュベーションの終了時に再度混合します。
次に、遠心分離機にかけ、室温で15分間。ワイドボアピペットチップを使用して、水性層を新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに慎重に移し、界面からの材料を含めないようにします。750マイクロリットルの容量の室温100%イソプロパノールを加え、チューブを6回静かに反転させます。
次に、混合物を室温で15分間遠心分離します。上澄みを慎重に取り除き、捨てます。450マイクロリットルを予め冷却した70%エタノールを加えます。
混合物を室温で5分間遠心分離します。上澄みを慎重に取り除き、捨てます。1000倍のgで3秒間遠心分離します。
細いピペットチップで上澄みを慎重に取り除き、上澄みを捨てます。ペレットを室温で15分間風乾します。ペレットを 300 マイクロリットルの TE に再懸濁します。DNAを摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌朝、溶液に入らなかったDNAを静かにフリックして再懸濁します。RNAコンタミネーションを除去するには、10マイクロリットルのRNaseを追加します。チューブを3回静かに反転させ、DNAを1000倍のgで3秒間遠心分離します。
次に、DNAを摂氏37度で2時間インキュベートします。300マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加え、穏やかに反転させて5回混合し、室温でDNAを10分間インキュベートします。チューブを静かに反転させて、中間点でDNAを5回混合し、インキュベーションの終了時に再度混合します。
次に、チューブを室温で15分間遠心分離します。ワイドボアピペットチップを使用して、上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。3マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムpH 5.2を加え、チューブを5回静かに反転させます。
750マイクロリットルの予め冷やした100%エタノールを加え、チューブを5回静かに反転させます。混合物を摂氏20度で一晩インキュベートします。翌朝、チューブを摂氏4度で30分間遠心分離します。
上清を慎重に取り除いて捨てます。予め冷やした70%エタノールを450マイクロリットル加えます。次に、チューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。
DNAをペレット化した後、上清を慎重に取り除きます。チューブを再び1000倍gで3秒間回転させ、残留上清を下げます。先端の細いピペットで残留上清を取り除きます。
ペレットを室温で30〜60分間風乾します。風乾後、ペレットを27.5マイクロリットルのTEに再懸濁します。翌日、静かに裏返して、溶液に入らなかった残留物質を再懸濁します。品質管理テストのために、2.5マイクロリットルを22.5マイクロリットルTEに分注します。
シーケンシングのために提出するまで、DNAサンプルを摂氏4度で保管します。長期保存の場合は、サンプルを摂氏80度で保存し、凍結融解サイクルを最小限に抑えてせん断を防ぎます。プロトコルを使用して、精製されたゲノムDNAをゲル電気泳動に使用し、20kbpを超える強力な単一バンドと最小限のスミアリングで品質管理に合格したDNA、20kbpを超えるシングルバンドで限界結果をもたらしたDNA、および20kbp未満のスミアリングを示し、100bpのフラグメントを含む失敗した結果を得ました。
パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)は、DNAの過半数が48.5kbpを超える許容可能なDNAサンプルと、DNAの大多数が20〜48.5kbpの辺縁DNAサンプルを区別するために実施されました。この手順に続いて、うどんこ病ゲノムに関する追加の質問に答えるために、単一分子ロングリードシーケンシングなどの他の方法を実行できます。
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概要
このプロトコルは、絶対生養真菌性病原体であるうどんこ病、特に単相接合胞子から高分子量ゲノムDNAを分離する手法を概説しています。この技術は長読取ゲノムシーケンシング用に設計されており、複雑な真菌ゲノムの研究における課題に対処します。
主要な研究要素
科学の分野
- 植物病理学
- 真菌生物学
- ゲノミクス
背景
- うどんこ病は重要な植物病原体です。
- 高品質なゲノムDNAの抽出はゲノム研究にとって重要です。
- 長読取シーケンシングは複雑なゲノム構造の洞察を提供します。
- この方法は扱いにくい病原体の研究の実現可能性を向上させます。
研究の目的
- うどんこ病からゲノムDNAを抽出し精製すること。
- 長読取ゲノムシーケンシングを容易にすること。
- 真菌の病原性とゲノム構造の理解を深めること。
使用した方法
- マグネットを使用して接合胞子クライオバイアルからスチールボールを取り除く。
- 65度セルシウスの溶解バッファーを加えること。
- 溶液を渦巻き状に混合してスラリーを形成すること。
- DNA抽出と精製のための後続のステップ。
主な結果
- 高分子量ゲノムDNAの成功的な分離。
- 効果的な溶解を示すスラリーの形成。
- 長読取シーケンシングアプリケーションのための準備。
- 真菌生物学における主要な質問に答える可能性。
結論
- この方法はうどんこ病からのDNA抽出のための信頼できるアプローチを提供します。
- 研究者が複雑な真菌ゲノムを研究することを可能にします。
- この技術は植物-病原体相互作用についての理解を進めることができます。
