Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

טכניקה מבוססת היטב לשינוי רצפים ספציפיים בגנום היא פילוח גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית, אך שיטה זו יכולה להיות מייגעת ופועלת רק באורגניזמים מסוימים. ההתקדמות האחרונה הובילה לפיתוח "עריכת גנום", אשר פועלת על ידי גרימת שבירות גדיל כפול ב- DNA באמצעות אנזימי נוקלאז מהונדסים מונחים לאתרים גנומיים ממוקדים על ידי חלבונים או RNAs המזהים רצפים ספציפיים. כאשר תא מנסה לתקן נזק זה, מוטציות ניתן להכניס לתוך אזור ה- DNA היעד.

בסרטון זה, JoVE מסביר את העקרונות שמאחורי עריכת הגנום, ומדגיש כיצד טכניקה זו מתייחסת למנגנוני תיקון DNA. לאחר מכן נבדקות שלוש שיטות עיקריות לעריכת גנום – גרעיני אצבע אבץ, TALENs ומערכת CRISPR-Cas9 – ולאחריהן פרוטוקול לשימוש ב-CRISPR ליצירת שינויים גנטיים ממוקדים בתאי יונקים. לבסוף, אנו דנים במחקר הנוכחי המיישם עריכת גנום כדי לשנות את החומר הגנטי באורגניזמים מודל או תאים בתרבית.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עריכת הגנום כוללת טכניקות שבהן חוקרים יכולים "לערוך" או לשנות רצף דנ"א ספציפי. שיטות אלה מסתמכות על יצירת "חתכים" קטנים ב- DNA, אשר תאים מנסים לתקן, לעתים קרובות באופן חלקי. באופן זה, מדענים יכולים לגרום מוטציות ברצפים ממוקדים עם יעילות רבה יותר בהשוואה פילוח גנים קלאסי.

בסרטון זה נסקור את העקרונות שמאחורי שלוש טכניקות לעריכת גנום, ונדון בפרוטוקול כללי עבור אחת מהן, מערכת CRISPR-Cas9. לאחר מכן נחקור כמה יישומים של שיטות אלה.

ראשית, בואו נסתכל על העקרונות שמאחורי עריכת הגנום.

השיטה הקלאסית להכנסת שינויים גנטיים לרצפים ספציפיים בגנום היא פילוח גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית, שבה שילוב רצפים הומולוגיים במבנה המיקוד מוביל ל"מעבר " של הגן האנדוגני לגרסה שונה.

בדומה לפילוח גנים, עריכת גנום יכולה למקד שינויים באזורי דנ"א ספציפיים, אך היא יכולה לעשות זאת ביעילות גבוהה בהרבה, ולבסס את המוטציות הרצויות ביותר תאים בכל ניסוי נתון.

כל שיטות עריכת הגנום מסתמכות על יכולתו של תא לתקן שברים כפולים שנעשו לדנ"א שלו על ידי אנדונוקלאזים. נזק זה עשוי להיות מתוקן על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגי או NHEJ, שבו קצות DNA שבורים נחסמים מחדש ישירות; או על ידי תיקון או HDR מונחה ההומולוגיה, שבו הנזק קבוע על ידי העתקה מתבנית הומולוגית. NHEJ אינו מושלם בדרך כלל, ועלול לגרום למחיקה או הוספה של מספר בסיסים ל- DNA המתוקן, ובכך לשנות את רצף היעד. מצד שני, HDR מאפשר לחוקרים להוסיף תבנית כדי לכוון שינויים ספציפיים לאתר היעד.

שלוש טכניקות עריכת גנום עיקריות פותחו והפכו לפופולריות בשנים האחרונות.

בשיטה אחת, חוקרים משלבים תחומים מחייבי DNA של "אצבע אבץ" של גורמי שעתוק מסוימים לתחום מבקע ה- DNA של FokI endonuclease. מכיוון שכל תחום אצבע אבץ מזהה שלישיית נוקלאוטיד ספציפית, ניתן לקשר תחומים אלה באופן מלאכותי כדי להנדס גרעיני אצבע אבץ, או ZFNs, המתמקדים ברצפי דנ"א ייחודיים.

באופן דומה, גרעינים הנקראים "TALENs" מצטרפים לפוק1 לתחומים המשתנים של חלבונים חיידקיים הנקראים מפעילי שעתוק, או TALEs. כל תחום TALE מזהה בסיס DNA יחיד וייחודי, ומעניק ל- TALENs את הספציפיות שלהם לרצף.

לבסוף, מערכת CRISPR-Cas9 משתמשת ברכיבים של מערכת חיסונית פרוקריוטית שבדרך כלל מגנה על הפונדקאי שלה מפני פלישה על ידי חומרים גנטיים זרים, כמו אלה בווירוסים או פלסמידים. במערכת זו, פיסות דנ"א זר פולש הנקראות "protospacers" משולבות בלוקוס CRISPR, אשר מתומלל ומעובד על ידי מכונות חלבון-RNA לתוך RNAs קטנים הנקראים crRNAs.

מדענים רותמים את מכונות CRISPR למטרות עריכה גנומית על ידי עיצוב רצפי מדריך דמויי CRRNA המכונים "מדריך יחיד" או sgRNA, אשר ניתן להשתמש בהם כדי למקד את Cas9 כמעט לכל רצף גנטי רצוי בתאי יונקים, או מערכות עניין אחרות. יכולת ההתאמה האישית הפשוטה של מערכת CRISPR-Cas9 מבוססת רצף הרנ"א מספקת יתרונות ברורים על פני שיטות עריכת גנום מבוססות חלבון כמו ZFNs ו-TALENs.

כעת, לאחר שלמדתם על העקרונות שמאחורי עריכת הגנום, בואו נסקור פרוטוקול טיפוסי של שימוש ב-CRISPR כדי ליצור שינויים גנטיים ממוקדים בתאי יונקים.

ראשית, נבחר מיקום גנומי לעריכה. אזור זה חייב להיות קצר - כ- 20 זוגות בסיס בגודל - ובעל מוטיב "פרוטוספייסר סמוך" ארוך של 3 בסיסים או "PAM" בקצה 3′. ה- PAM נדרש כדי ש- Cas9 יזהה ויבקע את אזור הדנ"א של היעד, והרצף המדויק הוא ספציפי לאורגניזם המקור של ה- Cas9 הנמצא בשימוש. לאחר שזוהה אתר פוטנציאלי, יש לחפש אותו מול רצף הגנום כדי להבטיח שאתרים דומים לא יימצאו במקום אחר בגנום, ולכן לא ייערכו אזורים גנומיים מחוץ למטרה.

כדי לסנתז את רצף קו היישור CRISPR, נוצרים שני אוליגונוקלאוטידים, אחד זהה ואחד משלים לרצף היעד. רצפים נוספים כלולים בקצוות 5′ שלהם לצורך תאימות עם וקטורים sgRNA. לאחר מכן, אוליגונוקלאוטידים אלה מעורבבים יחד, מושפלים, ואז מחושים.

לאחר מכן, פלסמיד המכיל "פיגום" של sgRNA נחתך עם אנזים ההגבלה המתאים, מעורבב עם רצף מדריך CRISPR מסונתז, ודגורה עם אנזים ליגאז כדי ליצור את מבנה sgRNA. לאחר מכן ניתן להפוך את הפלסמיד לחיידקים ולתרבות להגברה. לאחר שטוהר מחיידקים, מבנה CRISPR מועבר בשיתוף עם מבנה קידוד Cas9 לתוך התאים שהגנום שלהם יש לערוך. תאים אלה שהודבקו מתורבתים ויוצרים מושבות כליות.

ניתן לבודד את הדנ"א הגנומי מכל מושבה ולנתח אותו על ידי PCR או רצף כדי לסנן את אלה שבהם מערכת CRISPR הפיקה את המוטציות הרצויות.

בואו נסתכל על כמה דרכים שבהן מדענים משתמשים בטכניקות עריכת גנום.

חוקרים רבים משתמשים בעריכת גנום כדי להכניס רצפי כתבים ללוצי ספציפי. בניסוי זה, ZFNs שימשו להחדרת חלבון פלואורסצנטי ירוק לגן המעורב בהתפתחות נוירונים והישרדות. החוקרים אישרו כי הם התמקדו נכון בגן זה על ידי הנחת תאי גזע להבדיל לנוירונים, וביצוע אימונופלואורסצנטיות כפולה עבור GFP וסמנים עצביים.

עריכת הגנום גם הקלה בהרבה על יצירת אורגניזמים "נוקאאוט" שבהם גן מעניין הופך ללא פונקציונלי. כאן, החוקרים ביקשו ליצור עכברי נוקאאוט על ידי הזרקת עוברים עם סיפורי קידוד mRNA המכוונים לגנים ספציפיים. טיפול אנדונוקלאז לאחר מכן של DNA מעכברים שטופלו TALEN אפשר לחוקרים לזהות בעלי חיים עם מוטציות בשני העותקים של הגן הממוקד.

לבסוף, עריכת גנום יכולה לשמש ליצירת מחיקות גנטיות גדולות על ידי גרימת שתי הפסקות גדיל כפול באותו אזור כרומוזומלי. מחיקות גדולות אלה עשויות להיות נחוצות כאשר הפונקציה של גן או אלמנט גנטי לא ניתן לדפוק על ידי מחיקות קטנות שנוצרו עם פרוטוקולי עריכת גנום קונבנציונאלי. כאן, החוקרים שיתוף אלקטרופורציה תאים סרטניים עכבר עם מבנה GFP ושני מבנים CRISPR מיקוד אזורים שונים בתוך גן נהיגה בסרטן. תאים שהודבקו בהצלחה, אשר ובכך פולטים אות GFP, היו מבודדים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ו- PCR ורצף תאים מזוהים הבאים שבהם נמחק אזור ה- DNA בין שני האתרים הממוקדים על-ידי CRISPR.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על עריכת גנום. כאן, סקרנו את העקרונות שמאחורי ZFNs, TALENs ו- CRISPR, חקרנו פרוטוקול CRISPR-Cas9 כללי ודנו באופן שבו חוקרים משתמשים בטכניקות עריכת גנום כיום. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter