Индукция и диагностика опухолей в Drosophila Имагинальный диск Эпителия

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить клоны тумерогенной мозаики в развивающихся имагинальных дисках дрозофилы, а затем классифицировать клональные поражения по различным стадиям развития опухоли. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в моделировании рака. Например, как последовательно индуцировать опухоли и как классифицировать стадию прогрессирования.

Основные преимущества этой методики заключаются в том, что инъекция опухоли в имагинальные диски крыльев дрозофилы осуществляется с использованием простой генетики мух, а классификация стадий развития опухоли является простой диагностикой. Вместе с Кентой Моримото, демонстрирующим процедуру, будет Кимико Моримото, техник из моей лаборатории. Начните с создания генетического скрещивания.

За 12 часов до сбора девственниц на крест очистите от всех взрослых мух флаконы, содержащие половозрелых куколок. На следующий день установите скрещивание для получения генетически мозаичного потомства. Пересадите от 12 до 20 девственниц и 10 самцов в свежий флакон и высиживайте их в течение одного дня при температуре 25 градусов Цельсия.

Через 24 часа переложите мух в свежий флакон и выбросьте первый флакон, который они заполнили. Еще через 12 часов яйца начнут становиться доступными. С интервалом в 12 часов пересадите взрослых особей в новые флаконы и используйте потомство для эксперимента.

После инкубации флаконов с яйцами в течение двух-четырех дней при температуре 25 градусов Цельсия подвергните личинок тепловому шоку в течение 10-45 минут, используя водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия, для индукции мозаичных клонов с помощью флип-аута GAL4. Тепловой шок на два дня развития приведет к образованию клонов в незрелых дисках. Тепловой шок на три или четыре дня разработки, позволит создать клоны в более поздних дисках.

После теплового шока верните флаконы в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия, пока не появятся личинки третьего возраста. Для начала используйте деревянную палку или тупые щипцы, чтобы перенести блуждающих личинок третьего возраста в чашку Петри с PBS. Затем генотипируйте их под флуоресцентным светом, чтобы определить подходящие флуоресцентные маркеры для мозаичных личинок.

Прежде чем приступить к работе, промойте личинок PBS. Затем под микроскопом вскрытия с помощью двух пар щипцов защемите центр личинки, и разорвите тело пополам. Далее зажмите крючки для рта, одновременно подталкивая рот к телу, чтобы вывернуть корпус наизнанку.

Затем удалите ненужные материалы, такие как слюнные железы и жировые тела. Теперь личинки подготовлены к фиксации и окрашиванию антителами, что подробно описано в текстовом протоколе. Переложите испачканные тканевые препараты на предметное стекло микроскопа с помощью двухмиллилитровой пластиковой переводной пипетки.

Затем с помощью щипцов переместить отдельную личинку в капли монтажной среды на предметное стекло микроскопа. Теперь с помощью щипцов изолируйте имагинальные диски. Начните с удержания конца рассеченной ткани и оттягивания мозга и глазных антенных дисков с помощью других щипцов.

Держите мозг готовым к использованию. Теперь найдите имагинальные диски крыла. Имагинальные диски крыла приклеены к боковой стороне рассеченной ткани.

Далее закрепите ткань одним щипцом, и аккуратно соскребите диски крыльев. Затем расположите мозги рядом с дисками крыльев, чтобы защитить их от раздавливания покровным стеклом. Теперь аккуратно накройте конструкции покровным стеклом и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей.

Храните предметное стекло при температуре четыре градуса Цельсия. После использования конфокального микроскопа для получения изображений конфокального Z-стека откройте их в ImageJ и используйте команду Reslice для создания виртуальных срезов. Они могут быть выполнены по оси X-Z, оси Y-Z или в индивидуальной плоскости.

Чтобы создать настраиваемую плоскость, нарисуйте прямую линию или прямоугольник на изображении Z-стека и следуйте инструкциям, чтобы компьютер сгенерировал его сечение. Используйте такие срезы для диагностики тканей по фенотипам опухоли. Во-первых, определите клеточные массы, которые отклоняются или проявляют рост от основного эпителиального слоя.

Затем для каждой массы определите, является ли субклеточная локализация соединительных белков нормальной. Другие соображения включают размер образования и любые признаки увеличения пролиферации клеток в массе. Таким образом, выявляется тип опухоли.

В этом примере были классифицированы четыре клона с использованием вертикальных сечений, сгенерированных программным обеспечением для обработки изображений. Два из них были классифицированы как дисплазия, потому что меченый белок DLG был неправильно локализован. Клон B имеет размер менее четырех клеток, а клон C не отклоняется от эпителия.

Таким образом, ни В, ни С не были классифицированы как новообразование. Два других клона также показали неправильную локализацию DLG и образовали опухолевые клеточные массы за пределами эпителия. Поскольку размер этих смещенных опухолевых клонов составлял более четырех клеток в диаметре, эти клоны были классифицированы как неопухолевые.

С помощью описанных методов ген LGL был сбит в крыльчатой сумке и шарнирной областях с помощью РНК-интерференции, управляемой sd-GAL4. В контрольной группе, в которой отсутствовал трансген РНК-интерференции, не наблюдалось морфологических изменений в дисках крыльев третьего возраста. При нокдаунах в определенных частях шарнира отчетливо наблюдались эпителиальные деформации и опухолегенные разрастания.

Тем не менее, диспластический чрезмерный рост не наблюдался в области крыла-мешка. Это обратно коррелировало с экспрессией MMP1 в этих областях: белка, который обеспечивает метастатическую способность. Для мониторинга прогрессирования опухолевого роста, вызванного нокдауном ЛГЛ, в дисках крыльев генерировали спорадические клоны, экспрессирующие РНК ЛГЛ, как описано.

Через два дня после теплового шока у личинок второго возраста у некоторых нокдаун-клонов в шарнирной области наблюдалось отклонение от апикальной стороны эпителиального слоя. Через четыре дня после индукции теплового шока стали ясны диспластические поражения в области шарнира, что позволяет предположить, что нокдаун-клоны ЛГЛ, смещенные с апикальной стороны, пролиферируют в просвете. Через семь дней после индукции теплового шока в шарнирных областях преобладали опухолегенные разрастания.

При использовании систем GAL4 важно помнить о влиянии измененного времени теплового шока на клональные фенотипы, потому что опухолевый потенциал клеток имагинального диска может зависеть от стадии развития, эндогенных сигнальных событий или клеточной дифференцировки.