Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

This content is Free Access.

Hebrew
אסיית ביוטינילציה על פני תא
 
Click here for the English version

אסיית ביוטינילציה על פני תא

Overview

תא יכול לווסת את כמות החלבונים הספציפיים על קרום התא שלו באמצעות אנדוציטוזיס, ולאחר מכן חלבונים על פני התא מופרדים ביעילות בציטופלסמה. ברגע שבתוך התא, חלבוני שטח אלה יכולים להיהרס או "ממוחזר" בחזרה לממברנה. ביוטינילציה פני התא מספק לחוקרים דרך לחקור תופעות אלה. הטכניקה עושה שימוש בנגזרת של ביוטין המולקולה הקטנה, אשר יכול לתייג חלבונים פני השטח ולאחר מכן להיות מבקע כימית. עם זאת, אם חלבון פני השטח הוא אנדוציטו, נגזרת ביוטין יהיה מוגן מפני מחשוף. לכן, על ידי ניתוח תווית הביוטין הטמאה, האנדיציטוס, מדענים יכולים להעריך את כמויות חלבוני השטח המופנמים.

בסרטון זה, אנו סוקרים את המושגים שמאחורי בדיקת הביוטינילציה, מתעמקים במבנה הכימי של נגזרת הביוטין ובמנגנון המחשוף שלה. זה ואחריו פרוטוקול כללי של הטכניקה, ולבסוף, תיאור של איך חוקרים משתמשים בו כיום כדי לחקור את הדינמיקה של חלבונים שונים על פני התא.

Procedure

תיוג חלבונים על פני התא עם ביוטין מהווה כלי רב עוצמה לחקר מסלולי הובלה תאיים המעורבים בוויסות חלבוני הממברנה. תא שומר על קבוצה מווסתת היטב של חלבונים על פני השטח, כך שהוא יכול לקבל ולהגיב למידע חוץ תאי באמצעות מספר מסלולי איתות. אנדוציטוזיס, תהליך של ציפה, מוצע להיות מעורב בוויסות חלבונים אלה על פני התא על ידי גרימת הפנמתם. לכן, תיוג חלבונים אלה לפני שהם אנדוציטו עם סוכנים כמו ביוטין מסייע למדענים לכמת את ההפנמה שלהם וללמוד את תפקידם במסלולים הסלולר.

בסרטון זה, נדון בעקרונות ובמתודולוגיה של בחינות ביוטילציה של פני תא, ונחקור כמה דרכים שבהן מדענים מתאימים שיטה זו כיום.

בואו נסקור תחילה את העקרונות מאחורי בדיקת הביוטינילציה של פני התא.

כפי שהוזכר קודם לכן, תאים להשתמש במסלולים אנדוציטיים כדי לווסת את הצפיפות spatiotemporal והפצה של חלבוני שטח. חלבונים מופנמים מועברים דרך מסלולים תאיים ספציפיים, ולאחר מכן ניתן להסיט אותם אל ליזוזום להשפלה, או ממוחזר בחזרה למשטח התא להמשך הפעילות. ביוטינילציה על פני התא נועדה למדוד תהליכים אלה.

התג המשמש בבוחן זה, ביוטין – הידוע גם בשם ויטמין H – הוא מולקולה קטנה ומסיסה במים. נגזרת נפוצה של ביוטין לניסויי תיוג פני השטח היא סולפו-NHS-SS-ביוטין, המורכב מקבוצת סולפו, קבוצת אסתר תמציתי N-הידרוקסית, קשר דיסולפיד, וכמובן ביוטין. בואו לפשט את המבנה העצום הזה על ידי החלפת ביוטין באות "B".

קבוצת הגופרית במבנה זה מעניקה מטען חזק שהופך צורה זו של קרום ביוטין לחדירה. תיוג של חלבונים על פני התא נעשה על ידי הוספת סולפו-NHS-SS-ביוטין לתאים שנשמרים בטמפרטורה המגבילה לאנדוציטוזיס. קבוצת NHS מגיבה עם האמינים העיקריים על חלבוני שטח, ויוצרת קשרים קוולנטיים.

לאחר מכן, התאים המסומנים מועברים לטמפרטורה מתירנית לאנציטוזיס, שבמהלכה חלק מהחלבונים המסומנים יופנמו. לבסוף, תאים מועברים בחזרה לטמפרטורה המגבילה כדי לעצור אנדוציטוזיס. על מנת לכמת באופן ספציפי חלבונים מופנמים, מתווסף חומר הפחתת הידרופילי, אטום ממברנה - כמו L-גלוטתיון - נוסף. זה יגיב עם קשרים דיסולפידים על ביוטין סולפו-NHS-SS unendocytosed, וקבוצות ביוטין cleave כבוי. בשלב זה, חלבונים ביוטינילים הנותרים הם אלה שהתוויות שלהם היו מוגנות מפני סוכן ההפחתה מכיוון שהם הופנמו בעבר.

לאחר מכן, התאים מתמוססים, והחלבונים הביוטינילים האנדיוציאטוס מבודדים לכימות. בידוד מבוצע בדרך כלל על ידי הוספת lysates התא חרוזים סינתטיים מצופים סטרפטאבידין. מאז סטרפטאבידין יש זיקה גבוהה מאוד ביוטין, חלבונים biotinylated לצרף את עצמם חרוזים מצופים. סדרה של של שלבי כביסה להסרת חלבונים מזהמים, ולבסוף צעד חמקמק, מבוצעת לשחרור חלבונים מאוגדים. לאחר מכן ניתן לנתח את חלבוני היעד על ידי טכניקות כמו סופג מערבי.

מאז עכשיו אתה יודע את המושגים מאחורי ביוטינילציה אסאי, בואו נסתכל על פרוטוקול כללי מראה כיצד לבצע את ההליך הזה כדי למדוד אנדוציטוזיס של חלבוני שטח.

התחל עם תאים בתרבית מקורר ל 4°C. מניחים אותם על קרח כדי לשמור על הטמפרטורה המגבילה לאנדיציטוזיס. לאחר מכן, קרום בלתי חדיר גופרו-NHS-SS-ביוטין ריאגנט מתווסף, ותאים הם דגירה בחושך במשך כ 30 דקות. זה מאפשר מספיק זמן עבור תוויות ביוטין להתחבר covalently חלבונים פני השטח. לאחר מכן תאים מוסרים מקרח ודגרה ב 37°C במשך כ 30 דקות. בטמפרטורה זו, חלבוני שטח ביוטינילים הם אנדוציטו. לאחר הדגירה, התאים מקוררים ל 4 מעלות צלזיוס, וסוכן הפחתת הידרופילית כמו L-גלוטתיון מתווסף. זה מגיב עם קשרים דיסולפידים ומשחרר את קבוצות הביוטין מחלבונים מסומנים, לא אנדוציטוס.

לאחר מכן, תאים הם lysed על ידי צנטריפוגה, ובכך לשבור את קרום התא ולחשוף חלבונים ביוטינילציה. לאחר מכן, ליסאטים מתווספים חרוזים מצופים סטרפטאבידין וחלבונים ביוטינילציה מותרים להיקשר. חרוזים נשטפים עם תמיסת מלח חוצצת פוספט קר eluted עם חוצץ המכיל חומרי ניקוי וחומרי הפחתת. ריאגנטים אלה מגנים חלבונים קשורים בחררוזים ומאפשרים את החלמתם באלואט. חלבונים באקט מופרדים על בסיס המסה המולקולרית שלהם על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לבסוף, סופג מערבי וחיטוט של כתם עם נוגדנים ספציפיים לחלבון מאפשרים הדמיה של חלבון היעד. ניתן לכמת חלבון אנדוציטו באחוזים מצפיפות הרצועה הנובעת מכך.

עכשיו שאתם מבינים את המתודולוגיה של ביוטינילציה של תאים, בואו נסתכל על איך משתמשים בו בניסויים ספציפיים.

היישום הנפוץ ביותר של פרוטוקול ביוטינילציה זה הוא למדוד את הקצב האנציטי של חלבונים ספציפיים על פני התא. כאן, מדענים היו מעוניינים להעריך את ההפנמה של משגר דופמין או DAT. על ידי ביצוע הפרוטוקול הסטנדרטי, מדענים הצליחו למדוד את אחוז DATs אנדוציטו. זהו אימונובלוט מייצג המציג את נתיב T, המתאים לכמות "כוללת" של חלבון לפני ההפנמה, נתיב S מיועד לדגימות "מופשטות" שבהן תאים מעולם לא הורשו להמשיך דרך אנדוציטוזיס אלא טופלו בסוכן מפחית, ונתיב אני מייצג תוצאות של חלבונים "מופנמים".

בנוסף רק מדידת אנדוציטוזיס של חלבוני שטח, מדענים גם לבחון את ההשפעות של תרופות על תהליך זה. במחקר זה, החוקרים העריכו את צפיפות פני השטח של DATs בתגובה לטיפול עם מפעיל של חלבון קינאז C (PKC), שפעולתו הוצעה כדי לגרום הפנמת DAT. מדענים אישרו זאת על ידי התאמת פרוטוקול הביוטינילציה במבחנה לשימוש בבדיקת ex vivo על רקמת מוח העכבר. הנתונים חשפו אובדן של כ-30% של DAT מקרום התא, בתגובה להפעלת PKC.

לבסוף, על ידי tweaking את ביוטינילציה אסאי, מדענים יכולים גם למדוד מיחזור של חלבונים ממברנה. כאן, חוקרים חקרו את חלבון ערוץ פני השטח, CFTR, אחראי על ביצוע יונים כלוריד. כדי להעריך מיחזור, החוקרים ביצעו פרוטוקול ביוטינילציה סטנדרטי בקבוצה אחת של תאים, ושינו את הפרוטוקול עבור הקבוצה השנייה של תאים על ידי הוספת צעדים לאחר בקעת ביוטין את חלבוני פני השטח הבלתי אנדוציטוס. צעדים נוספים אלה כללו העלאת הטמפרטורה בחזרה ל 37°C כדי לאפשר מיחזור של חלק חלבוני קולטן מופנמים, ביוטין מתויג. על ידי חישוב ההבדל בין החלבונים המופנמים לפני ואחרי המיחזור מתרחש, מדענים אלה הצליחו לכמת אחוז CFTR ממוחזר בחזרה לממברנה.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לביוטינילציה על פני התא. הסרטון תיאר את הצעדים הפרוצדורליים של ההסתה הזו, והסביר את התגובה המתרחשת בכל שלב. לבסוף, חקרנו כמה ניסויים לדוגמה שהדגימו את תחולתה של שיטה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter