Overview
Na bioquímica, métodos de purificação à base de cromatografia são empregados para isolar compostos de uma mistura complexa. Dois desses métodos utilizados comumente por bioquímicos são a cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade. Na cromatografia de exclusão de tamanho, uma coluna repleta de contas porosas separa componentes de uma mistura baseada no tamanho. Por outro lado, a cromatografia de afinidade permite uma separação mais específica das biomoléculas usando uma coluna composta de fase estacionária, que contém ligantes específicos de alvo.
Este vídeo serve como uma introdução à exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade, bem como aos conceitos que os governam. Um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada por histidina por cromatografia de afinidade metálica imobilizada é descrito. Também são perfilas as aplicações para esses dois métodos cromatográficos em bioquímica e pesquisa biomédica.
"Cromatografia" refere-se a uma ampla gama de métodos utilizados para isolar um componente de uma mistura complexa, um passo essencial antes que as propriedades e atividades de uma biomolécula possam ser determinadas. Cada técnica cromatográfica tem um mecanismo diferente de separação, dependendo da matriz amostral e do composto alvo. Este vídeo se concentrará nos princípios e funcionamento de dois métodos comuns à bioquímica: a exclusão de tamanho e a cromatografia de afinidade.
A cromatografia de exclusão de tamanho ou SEC baseia-se no tamanho dos compostos da amostra. Uma fase móvel contendo a amostra é adicionada a uma coluna com um material poroso: a fase estacionária. As moléculas da amostra se enquadram em 1 de 3 categorias.
Moléculas grandes demais para entrar nos poros percorrem a menor distância através da coluna. Qualquer espécie com um peso molecular acima desse "limite de exclusão" sairá da coluna ao mesmo tempo. Moléculas pequenas o suficiente para entrar livremente nos poros serão retidas por mais tempo, e sairão da coluna juntas. O peso molecular que permite a entrada completa de poros é o "limite de permeação".
Apenas moléculas entre esses limites serão separadas umas das outras, pois gastam quantidades variadas de tempo se difundindo dentro e fora dos poros. Moléculas menores são retidas por mais tempo na coluna porque passam mais tempo na fase estacionária, enquanto moléculas maiores dentro desses limites saem mais cedo.
Pesos moleculares em 1 a 2 ordens de magnitude estão dentro desses limites. As colunas são escolhidas com isso em mente, ou várias colunas podem ser usadas em séries se houver uma ampla gama de compostos desejados.
Agora que você viu a teoria da SEC, vamos ver como ela é realizada.
Para iniciar o procedimento SEC, a coluna deve ser equilibrada com água desionizada e tampão de cromatografia. Uma vez preparado, o buffer contendo a amostra é injetado na coluna. O buffer é então empurrado através de uma taxa de fluxo baixa. Um detector monitora o que sai da coluna para determinar a presença do analito desejado. Moléculas grandes com pesos moleculares acima do limite de exclusão saem da coluna ao mesmo tempo. Pequenas frações da coluna são coletadas em tubos. Cada fração é testada para a qualidade da molécula alvo por eletroforese de gel ou outras técnicas analíticas.
Agora vamos dar uma olhada na cromatografia de afinidade ou AC, uma das formas mais eficientes de purificar proteínas. Muitas biomoléculas se ligam seletivamente a certos ligantes- uma propriedade que o AC utiliza ao aderir um ligante específico para o alvo à fase estacionária.
Quando a mistura flui através da coluna, as moléculas alvo se prendem ao ligante, e o resto flui. Após a mistura passar pela coluna, a molécula alvo pode ser coletada através de um dos dois métodos de elução baseados na especificidade.
A elução bioespecífica pode ser dita para ter um "papel normal" ou "reverso". Na elução bioespecífica de papel normal, um agente é adicionado que compete com o ligante aderido para se ligar com a biomolécula alvo.
Em elução bioespecífica de papel inverso, um agente compete com o alvo para se ligar ao ligante aderido. O segundo tipo de elução, elução inespecífica, reduz a ligação alvo-ligante alterando o pH da solução, a força iônica ou a polaridade. Se uma proteína não se liga a um ligante que pode ser imobilizado, a proteína pode ser expressa contendo uma "tag": sequências de peptídeos curtos projetadas para se ligar ao ligante.
Uma variedade é a cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizada, "IMAC" para abreviar, onde um ligante metálico aderido, como níquel ou cobalto, se liga aos resíduos de histidina na proteína modificada. Através de técnicas de biologia molecular, as proteínas-alvo são geradas com a repetição de resíduos de histidina, chamados de polyhistidina-tag, que se liga ao metal através da cadeia lateral imidazol na histidina. Uma vez vinculada, a proteína pode ser coletada com imidazol livre através de elução específica de função reversa e posteriormente usada em uma grande variedade de aplicações a jusante. Agora que você viu a teoria da cromatografia de afinidade, vamos olhar para um procedimento IMAC em laboratório.
No IMAC, a fase estacionária pode ser adicionada diretamente à mistura de fase móvel e amostra, permitindo a vinculação da proteína marcada. Este chorume é então derramado na coluna, onde os compostos não ligados escorrem em resíduos, enquanto o chorume permanece. O recipiente de chorume é enxaguado para coletar resina residual e amostra, que é adicionada à coluna.
A resina é agitada para garantir que os componentes desvinculados estejam fluindo livremente. O buffer de lavagem adicionado ajuda a lavá-los. Uma vez removidos todos os componentes não vinculados, os resíduos são substituídos por um recipiente para coletar a proteína alvo.
O tampão contendo imidazol é adicionado, agitado e autorizado a descansar para desvincular a molécula alvo. O imidazol se liga ao metal, substituindo e liberando a proteína marcada. A proteína liberada é coletada, e o passo imidazol é repetido para garantir a coleta total. Para purificar ainda mais a amostra, a SEC pode ser executada na amostra antes da análise.
Agora que vimos a teoria e o procedimento dessas duas técnicas, vamos ver algumas das maneiras como elas são aplicadas no campo bioquímico.
Uma razão comum para purificar proteínas é estudar seu papel na doença. A fibrose cística é causada por defeitos na proteína reguladora de condução de fibrose cística transmembrana, ou CFTR. Após o cultivo da proteína com uma marca na levedura, tanto a afinidade quanto a cromatografia de exclusão de tamanho permitem o isolamento da proteína, seguido pelo estudo de sua função.
Em alguns casos, a presença de uma tag de polihistidina pode alterar a estrutura de uma proteína, afetando assim sua função. Outra tag comum é a proteína de ligação de maltose ou MBP, que se ligará à amilose ligada em uma coluna. Maltose é então usado para liberar o complexo. O MBP pode então ser cortado e removido com SEC para produzir a proteína pura desejada.
Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade. Cobriu a teoria das técnicas, passou por procedimentos gerais e cobriu alguns dos usos das técnicas.
Obrigado por assistir!
Procedure
Na bioquímica, métodos de purificação à base de cromatografia são empregados para isolar compostos de uma mistura complexa. Dois desses métodos utilizados comumente por bioquímicos são a cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade. Na cromatografia de exclusão de tamanho, uma coluna repleta de contas porosas separa componentes de uma mistura baseada no tamanho. Por outro lado, a cromatografia de afinidade permite uma separação mais específica das biomoléculas usando uma coluna composta de fase estacionária, que contém ligantes específicos de alvo.
Este vídeo serve como uma introdução à exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade, bem como aos conceitos que os governam. Um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada por histidina por cromatografia de afinidade metálica imobilizada é descrito. Também são perfilas as aplicações para esses dois métodos cromatográficos em bioquímica e pesquisa biomédica.
"Cromatografia" refere-se a uma ampla gama de métodos utilizados para isolar um componente de uma mistura complexa, um passo essencial antes que as propriedades e atividades de uma biomolécula possam ser determinadas. Cada técnica cromatográfica tem um mecanismo diferente de separação, dependendo da matriz amostral e do composto alvo. Este vídeo se concentrará nos princípios e funcionamento de dois métodos comuns à bioquímica: a exclusão de tamanho e a cromatografia de afinidade.
A cromatografia de exclusão de tamanho ou SEC baseia-se no tamanho dos compostos da amostra. Uma fase móvel contendo a amostra é adicionada a uma coluna com um material poroso: a fase estacionária. As moléculas da amostra se enquadram em 1 de 3 categorias.
Moléculas grandes demais para entrar nos poros percorrem a menor distância através da coluna. Qualquer espécie com um peso molecular acima desse "limite de exclusão" sairá da coluna ao mesmo tempo. Moléculas pequenas o suficiente para entrar livremente nos poros serão retidas por mais tempo, e sairão da coluna juntas. O peso molecular que permite a entrada completa de poros é o "limite de permeação".
Apenas moléculas entre esses limites serão separadas umas das outras, pois gastam quantidades variadas de tempo se difundindo dentro e fora dos poros. Moléculas menores são retidas por mais tempo na coluna porque passam mais tempo na fase estacionária, enquanto moléculas maiores dentro desses limites saem mais cedo.
Pesos moleculares em 1 a 2 ordens de magnitude estão dentro desses limites. As colunas são escolhidas com isso em mente, ou várias colunas podem ser usadas em séries se houver uma ampla gama de compostos desejados.
Agora que você viu a teoria da SEC, vamos ver como ela é realizada.
Para iniciar o procedimento SEC, a coluna deve ser equilibrada com água desionizada e tampão de cromatografia. Uma vez preparado, o buffer contendo a amostra é injetado na coluna. O buffer é então empurrado através de uma taxa de fluxo baixa. Um detector monitora o que sai da coluna para determinar a presença do analito desejado. Moléculas grandes com pesos moleculares acima do limite de exclusão saem da coluna ao mesmo tempo. Pequenas frações da coluna são coletadas em tubos. Cada fração é testada para a qualidade da molécula alvo por eletroforese de gel ou outras técnicas analíticas.
Agora vamos dar uma olhada na cromatografia de afinidade ou AC, uma das formas mais eficientes de purificar proteínas. Muitas biomoléculas se ligam seletivamente a certos ligantes- uma propriedade que o AC utiliza ao aderir um ligante específico para o alvo à fase estacionária.
Quando a mistura flui através da coluna, as moléculas alvo se prendem ao ligante, e o resto flui. Após a mistura passar pela coluna, a molécula alvo pode ser coletada através de um dos dois métodos de elução baseados na especificidade.
A elução bioespecífica pode ser dita para ter um "papel normal" ou "reverso". Na elução bioespecífica de papel normal, um agente é adicionado que compete com o ligante aderido para se ligar com a biomolécula alvo.
Em elução bioespecífica de papel inverso, um agente compete com o alvo para se ligar ao ligante aderido. O segundo tipo de elução,elução inespecífica,reduz a ligação alvo-ligante alterando o pH da solução, a força iônica ou a polaridade. Se uma proteína não se liga a um ligante que pode ser imobilizado, a proteína pode ser expressa contendo uma "tag": sequências de peptídeos curtos projetadas para se ligar ao ligante.
Uma variedade é a cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizada, "IMAC" para abreviar, onde um ligante metálico aderido, como níquel ou cobalto, se liga aos resíduos de histidina na proteína modificada. Através de técnicas de biologia molecular, as proteínas-alvo são geradas com a repetição de resíduos de histidina, chamados de polyhistidina-tag, que se liga ao metal através da cadeia lateral imidazol na histidina. Uma vez vinculada, a proteína pode ser coletada com imidazol livre através de elução específica de função reversa e posteriormente usada em uma grande variedade de aplicações a jusante. Agora que você viu a teoria da cromatografia de afinidade, vamos olhar para um procedimento IMAC em laboratório.
No IMAC, a fase estacionária pode ser adicionada diretamente à mistura de fase móvel e amostra, permitindo a vinculação da proteína marcada. Este chorume é então derramado na coluna, onde os compostos não ligados escorrem em resíduos, enquanto o chorume permanece. O recipiente de chorume é enxaguado para coletar resina residual e amostra, que é adicionada à coluna.
A resina é agitada para garantir que os componentes desvinculados estejam fluindo livremente. O buffer de lavagem adicionado ajuda a lavá-los. Uma vez removidos todos os componentes não vinculados, os resíduos são substituídos por um recipiente para coletar a proteína alvo.
O tampão contendo imidazol é adicionado, agitado e autorizado a descansar para desvincular a molécula alvo. O imidazol se liga ao metal, substituindo e liberando a proteína marcada. A proteína liberada é coletada, e o passo imidazol é repetido para garantir a coleta total. Para purificar ainda mais a amostra, a SEC pode ser executada na amostra antes da análise.
Agora que vimos a teoria e o procedimento dessas duas técnicas, vamos ver algumas das maneiras como elas são aplicadas no campo bioquímico.
Uma razão comum para purificar proteínas é estudar seu papel na doença. A fibrose cística é causada por defeitos na proteína reguladora de condução de fibrose cística transmembrana, ou CFTR. Após o cultivo da proteína com uma marca na levedura, tanto a afinidade quanto a cromatografia de exclusão de tamanho permitem o isolamento da proteína, seguido pelo estudo de sua função.
Em alguns casos, a presença de uma tag de polihistidina pode alterar a estrutura de uma proteína, afetando assim sua função. Outra tag comum é a proteína de ligação de maltose ou MBP, que se ligará à amilose ligada em uma coluna. Maltose é então usado para liberar o complexo. O MBP pode então ser cortado e removido com SEC para produzir a proteína pura desejada.
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