Overview
In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D'altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle biomolecole utilizzando una colonna composta da fase stazionaria, che contiene ligandi specifici del bersaglio.
Questo video serve come introduzione alla cromatografia di esclusione delle dimensioni e affinità, nonché ai concetti che li governano. Viene descritta una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con istidina mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Sono inoltre profilate le applicazioni per entrambi questi metodi cromatografici in biochimica e nella ricerca biomedica.
"Cromatografia" si riferisce a una vasta gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passo essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto bersaglio. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: l'esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.
La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulla dimensione dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.
Molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Qualsiasi specie con un peso molecolare superiore a questo "limite di esclusione" uscirà dalla colonna allo stesso tempo. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori saranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l'ingresso completo dei pori è il "limite di permeazione".
Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l'una dall'altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.
I pesi molecolari da 1 a 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte con questo in mente, oppure più colonne possono essere utilizzate in serie se esiste una vasta gamma di composti desiderati.
Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un'occhiata a come viene eseguita.
Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il buffer contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il buffer viene quindi spinto attraverso a una bassa portata. Un rilevatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell'analita desiderato. Molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione escono contemporaneamente dalla colonna. Piccole frazioni dalla colonna sono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.
Ora diamo un'occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a determinati ligandi, una proprietà che AC utilizza aderendo un ligando specifico del bersaglio alla fase stazionaria.
Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto scorre attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione basati sulla specificità.
Si può dire che l'eluizione biospecifica abbia un ruolo "normale" o "inverso". Nell'eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi alla biomolecola bersaglio.
Nell'eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderente. Il secondo tipo di eluizione, l'eluizione non specifica, abbassa il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un "tag": brevi sequenze peptidiche progettate per legarsi al ligando.
Una varietà è la cromatografia di affinità ionica metallica immobilizzata, "IMAC" in breve, in cui un ligando metallico aderente, come nichel o cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag polistidina, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell'imidazolo sull'istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un'ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un'occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.
In IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina his-tagged. Questo liquame viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.
La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati siano a flusso libero. Il tampone di lavaggio aggiunto aiuta a lavarli via. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.
Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L'imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina etichettata. La proteina liberata viene raccolta e la fase di imidazolo viene ripetuta per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, SEC può essere eseguito sul campione prima dell'analisi.
Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate nel campo biochimico.
Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nella malattia. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia l'affinità che la cromatografia di esclusione dimensionale consentono l'isolamento della proteina, seguito dallo studio della sua funzione.
In alcuni casi, la presenza di un tag polistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzando così la sua funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si legherà all'amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L'MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.
Hai appena visto il video di JoVE sull'esclusione delle dimensioni e la cromatografia di affinità. Ha coperto la teoria delle tecniche, ha esaminato le procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D'altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle biomolecole utilizzando una colonna composta da fase stazionaria, che contiene ligandi specifici del bersaglio.
Questo video serve come introduzione alla cromatografia di esclusione delle dimensioni e affinità, nonché ai concetti che li governano. Viene descritta una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con istidina mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Sono inoltre profilate le applicazioni per entrambi questi metodi cromatografici in biochimica e nella ricerca biomedica.
"Cromatografia" si riferisce a una vasta gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passo essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto bersaglio. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: l'esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.
La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulla dimensione dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.
Molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Qualsiasi specie con un peso molecolare superiore a questo "limite di esclusione" uscirà dalla colonna allo stesso tempo. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori saranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l'ingresso completo dei pori è il "limite di permeazione".
Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l'una dall'altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.
I pesi molecolari da 1 a 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte con questo in mente, oppure più colonne possono essere utilizzate in serie se esiste una vasta gamma di composti desiderati.
Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un'occhiata a come viene eseguita.
Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il buffer contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il buffer viene quindi spinto attraverso a una bassa portata. Un rilevatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell'analita desiderato. Molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione escono contemporaneamente dalla colonna. Piccole frazioni dalla colonna sono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.
Ora diamo un'occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a determinati ligandi, una proprietà che AC utilizza aderendo un ligando specifico del bersaglio alla fase stazionaria.
Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto scorre attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione basati sulla specificità.
Si può dire che l'eluizione biospecifica abbia un ruolo "normale" o "inverso". Nell'eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi alla biomolecola bersaglio.
Nell'eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderente. Il secondo tipo di eluizione,l'eluizione non specifica,abbassa il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un "tag": brevi sequenze peptidiche progettate per legarsi al ligando.
Una varietà è la cromatografia di affinità ionica metallica immobilizzata, "IMAC" in breve, in cui un ligando metallico aderente, come nichel o cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag polistidina, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell'imidazolo sull'istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un'ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un'occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.
In IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina his-tagged. Questo liquame viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.
La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati siano a flusso libero. Il tampone di lavaggio aggiunto aiuta a lavarli via. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.
Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L'imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina etichettata. La proteina liberata viene raccolta e la fase di imidazolo viene ripetuta per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, SEC può essere eseguito sul campione prima dell'analisi.
Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate nel campo biochimico.
Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nella malattia. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia l'affinità che la cromatografia di esclusione dimensionale consentono l'isolamento della proteina, seguito dallo studio della sua funzione.
In alcuni casi, la presenza di un tag polistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzando così la sua funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si legherà all'amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L'MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.
Hai appena visto il video di JoVE sull'esclusione delle dimensioni e la cromatografia di affinità. Ha coperto la teoria delle tecniche, ha esaminato le procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
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