Overview
생화학에서, 크롬토그래피 계 정제 방법은 복합 혼합물로부터 화합물을 분리하기 위해 사용된다. 생화학자에 의해 일반적으로 이용되는 2개의 그 같은 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피입니다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 구슬로 포장된 컬럼은 크기에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 한편, 친화성 크로마토그래피는 표적 특이적 리간드를 포함하는 고정 상으로 구성된 컬럼을 사용하여 생체 분자의 보다 구체적인 분리를 허용한다.
이 비디오는 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이를 제어하는 개념에 대한 소개 역할을 합니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의한 히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차가 설명된다. 생화학 및 생의학 연구에서 이러한 크로마토그래피 방법을 모두 위한 응용 프로그램도 프로파일화되어 있습니다.
"크로마토그래피"는 복잡한 혼합물로부터 성분을 분리하는 데 사용되는 광범위한 방법을 말하며, 생체 분자의 특성 및 활동이 결정되기 전에 필수적인 단계입니다. 각 크로마토그래피 기술은 샘플 매트릭스 및 표적 화합물에 따라 분리를 위한 다른 메커니즘을 가지고 있습니다. 이 비디오는 생화학에 공통된 두 가지 방법의 원리와 작동에 초점을 맞출 것입니다: 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피.
크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC는 샘플내 화합물의 크기를 기반으로 합니다. 시료를 포함하는 이동상이 다공성 물질이 있는 컬럼에 고정된 위상을 추가합니다. 샘플의 분자는 3가지 범주 중 1개로 떨어집니다.
모공을 입력하기에는 너무 큰 분자가 컬럼을 통해 가장 짧은 거리를 이동합니다. 이 "배제 한계"를 초과하는 분자량을 가진 모든 종은 동시에 열을 종료합니다. 모공을 자유롭게 입력할 수 있을 만큼 작은 분자는 가장 오래 유지되고 컬럼을 함께 종료합니다. 완전한 기공 입구를 허용하는 분자량은 "투과 한계"입니다.
이러한 한계 사이의 분자만 모공 안팎으로 확산되는 데 다양한 시간을 소비하기 때문에 서로 분리됩니다. 더 작은 분자는 고정 된 단계에서 더 많은 시간을 보내고 있기 때문에 컬럼에서 더 오래 유지되는 반면, 이러한 한계 내에서 더 큰 분자는 이전에 종료됩니다.
1~ 2개의 진도에 걸친 분자량은 이러한 한계 내에 속한다. 이 점을 염두에 두고 컬럼을 선택하거나 원하는 화합물의 넓은 범위가 있는 경우 여러 열을 연속으로 사용할 수 있습니다.
이제 SEC의 이론을 보았으니 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
SEC 절차를 시작하려면 열에 분산된 물과 크로마토그래피 버퍼로 평형화되어야 합니다. 준비되면 샘플을 포함하는 버퍼가 열에 주입됩니다. 그런 다음 버퍼는 낮은 유량으로 밀어버리게 됩니다. 검출기는 열을 종료하는 것을 모니터링하여 원하는 단언의 존재를 확인합니다. 배제 한계 이상의 분자량을 가진 큰 분자는 동시에 컬럼을 종료합니다. 컬럼의 작은 분수는 튜브로 수집됩니다. 각 분획은 겔 전기전도 또는 기타 분석 기술에 의해 표적 분자의 품질을 테스트합니다.
이제 단백질을 정화하는 가장 효율적인 방법 중 하나인 친화성 크로마토그래피 또는 AC를 살펴보겠습니다. 많은 생체 분자는 AC가 고정 된 단계에 표적 별 리간드를 준수하여 활용하는 특정 리간드 -a 속성에 선택적으로 결합합니다.
혼합물이 컬럼을 통해 흐르면, 표적 분자는 리간드에 부착하고 나머지는 흐른다. 혼합물이 컬럼을 통과한 후, 표적 분자는 특이성에 기초하여 2개의 용출 방법 중 하나를 통해 수집될 수 있다.
생물특이적 용출은 "정상" 또는 "역역할"을 가지고 있다고 할 수 있다. 정상적인 역할 바이오특이적 용출에서, 표적 생체 분자와 결합하기 위해 부착된 리간드와 경쟁하는 에이전트가 추가됩니다.
역역할 바이오특이적 용출에서, 에이전트는 부착된 리간드에 결합하기 위해 대상과 경쟁한다. 제2 용출 형, 비특이적 용출은용액의 pH, 이온 강도 또는 극성을 변경하여 표적-리그-리간드 결합을 낮춥춥니까. 단백질이 고정될 수 있는 리간드에 결합하지 않으면, 단백질은 "태그"를 함유하여 표현될 수 있다: 리간드에 결합하도록 설계된 짧은 펩티드 서열.
한 가지 다양성은 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피, "IMAC"짧은, 여기서 부착 된 금속 리간드, 니켈이나 코발트와 같은, 수정 된 단백질에 히스티딘 잔류물에 결합. 분자 생물학 기술을 통해, 표적 단백질은 히스티딘의 이미다졸 사이드 체인을 통해 금속에 결합하는 폴리히스티딘 태그라고 불리는 히스티딘 잔류물을 반복하여 생성됩니다. 일단 결합되면, 단백질은 역역할 특정 용출을 통해 무료 imidazole로 수집될 수 있고 나중에 다양한 다운스트림 응용 분야에서 사용될 수 있습니다. 이제 친화성 크로마토그래피 이론을 보았으니 실험실에서 IMAC 절차를 살펴보겠습니다.
IMAC에서 고정 된 위상은 이동 상 및 샘플의 혼합물에 직접 첨가 할 수 있으므로 태그된 단백질의 결합을 허용합니다. 이 슬러리는 다음 슬러리가 남아있는 동안 비 결합 화합물이 폐기물로 떨어지는 기둥에 부어됩니다. 슬러리 용기는 잔류 잔류 및 샘플을 수집하기 위해 헹굴되며, 이는 컬럼에 추가됩니다.
수지는 언바운드 성분이 자유롭게 흐르도록 교반됩니다. 워시 버퍼가 첨가되어 세척 버퍼를 플러시할 수 있습니다. 모든 언바운드 성분이 제거되면 폐기물을 대상 단백질을 수집하는 용기로 대체됩니다.
imidazole를 함유 하는 버퍼추가, 교반, 그리고 대상 분자를 바인딩 해제 하기 위해 휴식 허용. imidazole는 금속에 결합하여 태그가 지정된 단백질을 대체하고 방출합니다. 해방된 단백질이 수집되고, 이미다졸 단계는 총 수집을 보장하기 위해 반복된다. 샘플을 더 정화하기 위해 SEC는 분석 전에 샘플에서 실행할 수 있습니다.
이제 우리는이 두 기술의 이론과 절차를 보았으니 생화학 분야에서 적용되는 몇 가지 방법을 살펴 보겠습니다.
단백질을 정화하는 일반적인 이유는 질병에 있는 그들의 역할을 공부하는 것입니다. 낭포성 섬유증은 낭포성 섬유증 막 전도도 성 조절 단백질 또는 CFTR의 결함에 기인합니다. 효모에 있는 그의 꼬리표로 단백질을 성장한 후에, 친화력과 크기 배제 크로마토그래피는 단백질의 분리를 허용하고, 그 기능에 대한 연구 결과에 선행됩니다.
어떤 경우에, 폴리히스티딘 태그의 존재는 단백질의 구조를 바꿀 수 있습니다, 따라서 그것의 기능에 영향을 미치는. 또 다른 일반적인 태그는 말토스 결합 단백질 또는 MBP, 컬럼에 결합 하는 아밀로스에 바인딩됩니다. 그런 다음 말토세(Maltose)는 복합체를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 MBP는 SEC와 함께 갈라지고 제거하여 순수한 단백질을 생산할 수 있습니다.
크기 배제 및 친화성 크로마토그래피에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 그것은 기술의 이론을 커버, 일반적인 절차를 통해 갔다, 기술의 사용의 일부를 커버.
시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
생화학에서, 크롬토그래피 계 정제 방법은 복합 혼합물로부터 화합물을 분리하기 위해 사용된다. 생화학자에 의해 일반적으로 이용되는 2개의 그 같은 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피입니다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 구슬로 포장된 컬럼은 크기에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 한편, 친화성 크로마토그래피는 표적 특이적 리간드를 포함하는 고정 상으로 구성된 컬럼을 사용하여 생체 분자의 보다 구체적인 분리를 허용한다.
이 비디오는 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이를 제어하는 개념에 대한 소개 역할을 합니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의한 히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차가 설명된다. 생화학 및 생의학 연구에서 이러한 크로마토그래피 방법을 모두 위한 응용 프로그램도 프로파일화되어 있습니다.
"크로마토그래피"는 복잡한 혼합물로부터 성분을 분리하는 데 사용되는 광범위한 방법을 말하며, 생체 분자의 특성 및 활동이 결정되기 전에 필수적인 단계입니다. 각 크로마토그래피 기술은 샘플 매트릭스 및 표적 화합물에 따라 분리를 위한 다른 메커니즘을 가지고 있습니다. 이 비디오는 생화학에 공통된 두 가지 방법의 원리와 작동에 초점을 맞출 것입니다: 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피.
크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC는 샘플내 화합물의 크기를 기반으로 합니다. 시료를 포함하는 이동상이 다공성 물질이 있는 컬럼에 고정된 위상을 추가합니다. 샘플의 분자는 3가지 범주 중 1개로 떨어집니다.
모공을 입력하기에는 너무 큰 분자가 컬럼을 통해 가장 짧은 거리를 이동합니다. 이 "배제 한계"를 초과하는 분자량을 가진 모든 종은 동시에 열을 종료합니다. 모공을 자유롭게 입력할 수 있을 만큼 작은 분자는 가장 오래 유지되고 컬럼을 함께 종료합니다. 완전한 기공 입구를 허용하는 분자량은 "투과 한계"입니다.
이러한 한계 사이의 분자만 모공 안팎으로 확산되는 데 다양한 시간을 소비하기 때문에 서로 분리됩니다. 더 작은 분자는 고정 된 단계에서 더 많은 시간을 보내고 있기 때문에 컬럼에서 더 오래 유지되는 반면, 이러한 한계 내에서 더 큰 분자는 이전에 종료됩니다.
1~ 2개의 진도에 걸친 분자량은 이러한 한계 내에 속한다. 이 점을 염두에 두고 컬럼을 선택하거나 원하는 화합물의 넓은 범위가 있는 경우 여러 열을 연속으로 사용할 수 있습니다.
이제 SEC의 이론을 보았으니 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
SEC 절차를 시작하려면 열에 분산된 물과 크로마토그래피 버퍼로 평형화되어야 합니다. 준비되면 샘플을 포함하는 버퍼가 열에 주입됩니다. 그런 다음 버퍼는 낮은 유량으로 밀어버리게 됩니다. 검출기는 열을 종료하는 것을 모니터링하여 원하는 단언의 존재를 확인합니다. 배제 한계 이상의 분자량을 가진 큰 분자는 동시에 컬럼을 종료합니다. 컬럼의 작은 분수는 튜브로 수집됩니다. 각 분획은 겔 전기전도 또는 기타 분석 기술에 의해 표적 분자의 품질을 테스트합니다.
이제 단백질을 정화하는 가장 효율적인 방법 중 하나인 친화성 크로마토그래피 또는 AC를 살펴보겠습니다. 많은 생체 분자는 AC가 고정 된 단계에 표적 별 리간드를 준수하여 활용하는 특정 리간드 -a 속성에 선택적으로 결합합니다.
혼합물이 컬럼을 통해 흐르면, 표적 분자는 리간드에 부착하고 나머지는 흐른다. 혼합물이 컬럼을 통과한 후, 표적 분자는 특이성에 기초하여 2개의 용출 방법 중 하나를 통해 수집될 수 있다.
생물특이적 용출은 "정상" 또는 "역역할"을 가지고 있다고 할 수 있다. 정상적인 역할 바이오특이적 용출에서, 표적 생체 분자와 결합하기 위해 부착된 리간드와 경쟁하는 에이전트가 추가됩니다.
역역할 바이오특이적 용출에서, 에이전트는 부착된 리간드에 결합하기 위해 대상과 경쟁한다. 제2 용출 형, 비특이적 용출은용액의 pH, 이온 강도 또는 극성을 변경하여 표적-리그-리간드 결합을 낮춥춥니까. 단백질이 고정될 수 있는 리간드에 결합하지 않으면, 단백질은 "태그"를 함유하여 표현될 수 있다: 리간드에 결합하도록 설계된 짧은 펩티드 서열.
한 가지 다양성은 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피, "IMAC"짧은, 여기서 부착 된 금속 리간드, 니켈이나 코발트와 같은, 수정 된 단백질에 히스티딘 잔류물에 결합. 분자 생물학 기술을 통해, 표적 단백질은 히스티딘의 이미다졸 사이드 체인을 통해 금속에 결합하는 폴리히스티딘 태그라고 불리는 히스티딘 잔류물을 반복하여 생성됩니다. 일단 결합되면, 단백질은 역역할 특정 용출을 통해 무료 imidazole로 수집될 수 있고 나중에 다양한 다운스트림 응용 분야에서 사용될 수 있습니다. 이제 친화성 크로마토그래피 이론을 보았으니 실험실에서 IMAC 절차를 살펴보겠습니다.
IMAC에서 고정 된 위상은 이동 상 및 샘플의 혼합물에 직접 첨가 할 수 있으므로 태그된 단백질의 결합을 허용합니다. 이 슬러리는 다음 슬러리가 남아있는 동안 비 결합 화합물이 폐기물로 떨어지는 기둥에 부어됩니다. 슬러리 용기는 잔류 잔류 및 샘플을 수집하기 위해 헹굴되며, 이는 컬럼에 추가됩니다.
수지는 언바운드 성분이 자유롭게 흐르도록 교반됩니다. 워시 버퍼가 첨가되어 세척 버퍼를 플러시할 수 있습니다. 모든 언바운드 성분이 제거되면 폐기물을 대상 단백질을 수집하는 용기로 대체됩니다.
imidazole를 함유 하는 버퍼추가, 교반, 그리고 대상 분자를 바인딩 해제 하기 위해 휴식 허용. imidazole는 금속에 결합하여 태그가 지정된 단백질을 대체하고 방출합니다. 해방된 단백질이 수집되고, 이미다졸 단계는 총 수집을 보장하기 위해 반복된다. 샘플을 더 정화하기 위해 SEC는 분석 전에 샘플에서 실행할 수 있습니다.
이제 우리는이 두 기술의 이론과 절차를 보았으니 생화학 분야에서 적용되는 몇 가지 방법을 살펴 보겠습니다.
단백질을 정화하는 일반적인 이유는 질병에 있는 그들의 역할을 공부하는 것입니다. 낭포성 섬유증은 낭포성 섬유증 막 전도도 성 조절 단백질 또는 CFTR의 결함에 기인합니다. 효모에 있는 그의 꼬리표로 단백질을 성장한 후에, 친화력과 크기 배제 크로마토그래피는 단백질의 분리를 허용하고, 그 기능에 대한 연구 결과에 선행됩니다.
어떤 경우에, 폴리히스티딘 태그의 존재는 단백질의 구조를 바꿀 수 있습니다, 따라서 그것의 기능에 영향을 미치는. 또 다른 일반적인 태그는 말토스 결합 단백질 또는 MBP, 컬럼에 결합 하는 아밀로스에 바인딩됩니다. 그런 다음 말토세(Maltose)는 복합체를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 MBP는 SEC와 함께 갈라지고 제거하여 순수한 단백질을 생산할 수 있습니다.
크기 배제 및 친화성 크로마토그래피에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 그것은 기술의 이론을 커버, 일반적인 절차를 통해 갔다, 기술의 사용의 일부를 커버.
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