Marcação Metabólica
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Overview
A rotulagem metabólica é usada para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem em uma célula. Isso é feito usando análogos químicos que imitam a estrutura de biomoléculas naturais. As células utilizam análogos em seus processos bioquímicos endógenos, produzindo compostos que são rotulados. O rótulo permite a incorporação de tags de detecção e afinidade, que podem então ser usadas para elucidar vias metabólicas utilizando outras técnicas analíticas bioquímicas, como SDS-PAGE e NMR.
Este vídeo introduz os conceitos de rotulagem metabólica e mostra dois procedimentos gerais. O primeiro usa rotulagem isotópica, para caracterizar a fosforilação de uma proteína. A segunda abrange uma rotulagem fotoreativa para caracterizar a interação proteína-proteína dentro de um Também são apresentadas três aplicações de rotulagem metabólica: rotulagem de material vegetal, rotulagem de RNA para medir cinética e rotulagem de glicocanos no desenvolvimento de embriões.
A rotulagem metabólica é usada para investigar o maquinário de uma célula. Isso é feito usando análogos químicos para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem. Este vídeo mostrará os princípios da rotulagem metabólica, procedimentos típicos de rotulagem isotópica e fotoreativa, e algumas aplicações.
A rotulagem metabólica pode ser conduzida utilizando uma série de estratégias. Aqui descreveremos a rotulagem isotópica, fotoreativa e bio-ortogonal.
A rotulagem isotópica é realizada usando análogos estruturais que são quimicamente idênticos às suas contrapartes naturais, mas têm isótopos incomuns incorporados em sua estrutura. Neste análogo L-lysine os átomos de carbono e nitrogênio são substituídos por carbono-13 e nitrogênio-15. Células cultivadas na presença de análogos isotópicos as incorporarão em suas estruturas bioquímicas. Metabólitos são coletados das células e purificados para análise. Amostras com isótopos estáveis são analisadas utilizando técnicas como espectrometria de massa ou espectroscopia de RN. Amostras com rótulos radioativos são analisadas utilizando-se a contagem de cintilação líquida e filmes de raio-x, que serão demonstrados no protocolo de rotulagem isotópica.
Rótulos fotoretivos são grupos funcionais incorporados em proteínas, que são estáveis até serem expostas à luz ultravioleta. O grupo funcional forma um radical reativo, que se liga à proteína mais próxima. Um exemplo comum, L-photo-leucine, contém um anel diazirina, que é um crosslinker fotoretivo. Em contraste com a rotulagem isotópica, há alguma diferença química entre os análogos químicos foto-reativos e suas contrapartes naturais. As células podem incorporar preferencialmente compostos naturais sobre análogos. Por isso, é importante realizar rotulagem foto-reativa em meio livre do composto que está sendo imitado. Uma vez expostos à radiação ultravioleta, os grupos foto-reativos em uma proteína rotulada tornam-se instáveis e altamente reativos, fazendo com que ela se conecte com proteínas interativas, criando um complexo proteico. Complexos intercriados, agem como instantâneos que podem ser analisados usando métodos de espectrometria de SDS-PAGE e de massa. Isso fornece insights sobre quais reações estão ocorrendo na via metabólica, identificando espécies de reação e como elas interagem determinando locais de ligação.
Estratégias bioortogonais de rotulagem utilizam análogos com pequenos grupos funcionais que têm pouca ou nenhuma reatividade com biomoléculas naturais. Por exemplo, azides são pequenos grupos funcionais, cuja reatividade é considerada ortogonal para reações bioquímicas. Na ligadura de Staudinger, um grupo de fosfina ataca o grupo azido. Isso produz um estado de transição que reage intramolecularmente com um éster próximo, resultando em um ligante ligado a amina. Grupos funcionais bioortogonais incorporados em biomoléculas podem ser ligados com marcas de detecção, como grupos funcionais fluorescentes, e tags de afinidade, como antígenos.
Agora que alguns conceitos e estratégias para rotulagem metabólica foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
O primeiro passo de um experimento de rotulagem metabólica é coletar a proteína do interesse. Para isso, as células são cultivadas em um prato, e um método de expressão é usado para promover a síntese da proteína desejada. Neste exemplo, as quinases repetidas ricas em leucina, ou LRRK, são expressas. Fosfato desódico, contendo fósforo radioativo-32, é usado como análogo. Medidas adequadas devem ser tomadas para proteger contra radiação ionizante. Isso inclui a criação de uma área de trabalho, o uso de equipamentos de proteção adequados e a verificação de contaminação radioativa. Uma vez tomadas medidas de segurança, o meio contendo os análogos isotópicos é preparado. O meio da cultura é removido e, substituído por um contendo os análogos químicos isotópicos e depois incubado. Após a incubação, as células são diluidas. O lise é coletado e purificado.
Após a purificação, as proteínas são resolvidas usando SDS-PAGE e depois transferidas para uma membrana PVDF. A autordiografia é realizada expondo a membrana ao filme de raio-x e medida por meio de um imager de fósforo. A mancha ocidental é usada para medir níveis relativos de proteína na membrana PVDF. Neste exemplo, foram medidos os níveis de fosforilação das quinases repetidas ricas em leucinas sintetizadas em células 293T. O autordiograma mostra o quanto o fósforo foi incorporado à proteína. A mancha ocidental elucida os níveis das proteínas LRRK. O software de análise de imagens é usado para obter dados quantitativos dos níveis de fosforilação das proteínas.
Neste próximo procedimento, a rotulagem fotoreativa é demonstrada. Primeiro, as células são preparadas e cultivadas. O analógico fotoretivo é adicionado às células na fase de registro médio e incubado. Neste procedimento é utilizado p-benzoilfenilalanina. As amostras são coletadas ao longo de intervalos e colocadas no gelo. As amostras são então expostas para obter instantâneos das vias bioquímicas ao longo do tempo. As proteínas de interesse são então purificadas e resolvidas usando SDS-PAGE.
Uma estratégia de rotulagem fotoreativa foi utilizada para identificar compostos que interagem com a proteína de interesse. A imunodetodoca com manchas ocidentais mostra bandas de proteínas que indicam que proteínas de maior peso molecular estão presentes nas amostras irradiadas. Estes são de ligação cruzada devido à interação proteína-proteína que ocorre durante a irradiação UV.
Agora que revisamos os procedimentos de rotulagem metabólica, vamos ver algumas das maneiras como o processo é usado.
Conceitos de rotulagem metabólica podem ser estendidos a organismos multicelulares. As plantas são cultivadas em um ambiente selado, rico em isótopos estáveis para material vegetal rotulado produzido. O dióxido de carbono contendo carbono-13 é adicionado ao recinto, enquanto o fertilizante rico em nitrogênio-15 é usado. O material vegetal colhido resultante pode ajudar a responder perguntas sobre o ciclismo de carbono e nitrogênio do ecossistema.
A rotulagem permite a separação do RNA recém-sintetizado do RNA mais antigo. Alterando a concentração inicial de analógico, a cinética da nova síntese de RNA pode ser determinada. Os resultados mostram que a concentração de 4-thiouridina afeta a quantidade de novo RNA transcrito. Além disso, as taxas de incorporação do rótulo em RNA podem ser diretamente quantificadas com um espectrômetro.
Usando química de clique biorthogonal, glicos em um embrião de peixe zebra podem ser rotulados. Os ovos são injetados com um composto de rotulagem que resulta em rótulos de alkyne nos glicanos. Os glicanos nas larvas são então ligados a um composto de corante na fase de desenvolvimento desejada. Os glicanos nos embriões são então imagens. Os glicanos produzidos em diferentes pontos de tempo podem ser identificados rotulando usando cores diferentes em diferentes estágios do desenvolvimento de embriões.
Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre rotulagem metabólica. Este vídeo descreveu os conceitos por trás da rotulagem metabólica e suas estratégias, passou por dois procedimentos gerais e cobriu alguns dos usos das técnicas.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
Now that we’ve reviewed metabolic labeling procedures, let’s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
You’ve just watched JoVE’s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
