Overview
Em conjunto espectrometria de massa, uma biomolécula de interesse é isolada de uma amostra biológica, e então fragmentada em múltiplas subunidades, a fim de ajudar a elucidar sua composição e sequência. Isso é feito por ter espectrômetros de massa em série. O primeiro espectrômetro ioniza uma amostra e filtrar íons de uma proporção de massa específica para carga. Os íons filtrados são então fragmentados e passados para um segundo espectrômetro de massa onde os fragmentos são analisados.
Este vídeo introduz os princípios da espectrometria de massa tandem, incluindo métodos de seleção em massa e dissociação. Também é mostrado um procedimento geral para analisar um composto bioquímico usando espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão. A seção de aplicações abrange monitoramento de reação de seleção, determinação de modificações de pós-tradução de proteínas e detecção de níveis de tacrolimus no sangue.
A espectrometria de massa tandem une múltiplos estágios de espectrometria de massa para primeiro isolar uma biomolécula e, em seguida, determinar aspectos de sua composição química. As biomoléculas possuem estruturas grandes e complexas, dificultando a determinação de sua composição molecular. A espectrometria de massa tandem seleciona uma molécula de interesse que é posteriormente fragmentada em múltiplas subunidades, o que pode ajudar a elucidar sua identificação e sequência. Este vídeo mostrará os conceitos de espectrometria de massa tandem, um procedimento geral, e alguns de seus usos na bioquímica.
A espectrometria de massa tandem começa como um instrumento típico de especificação de massa: com uma fonte de íons, que converte a amostra em íons, e um analisador de massa, que separa os íons com base em sua relação massa-carga. Um analisador de massa comum, o quadrupole, só permite íons com uma proporção específica através, enquanto os outros batem nas hastes do aparelho. A espécie permitida, chamada íon precursor, é a biomolécula de interesse. O íon se move para uma célula de colisão, tipicamente outro quadrúpole, onde a energia é aplicada para fragmentar o íon em um padrão previsível.
Esses fragmentos se movem para outro analisador em massa, como um tempo de voo, que separa esses "íons de produto". Os íons do produto são então enviados para o detector, como em um instrumento normal de MS. No caso de uma proteína desconhecida, o espectro resultante contém numerosos fragmentos sobrepostos, tornando difícil de gerar uma sequência completa definitiva da biomolécula. No entanto, o padrão espectral é único para uma determinada proteína. O software de análise compara o espectro a um banco de dados de sequências de peptídeos conhecidos, elucidando a proteína desconhecida dos fragmentos sobrepostos.
Dependendo da amostra e do grau desejado de fragmentação, são possíveis múltiplos métodos de fragmentação. Os padrões de fragmentação dependem de como a energia é transferida, sua quantidade e como ela é distribuída através do íon precursor. A energia pode ser transferida através de partículas neutras, radiação ou elétrons. Usando átomos neutros, um processo chamado dissociação induzida por colisão ou CID, principalmente se inclina na ligação peptídeo entre os aminoácidos, ideal para sua identificação.
Agora que o básico da técnica foi coberto, vamos olhar para a espectrometria de massa de CID tandem sendo usada para estudar um componente de envelopes de células bacterianas.
Como em todos os experimentos espectrométricos de massa, o primeiro passo é ionizar a amostra. Para biomoléculas, isso é tipicamente feito com desagrecção assistida por laser matricial ou ionização eletrospray. O sinal de íon precursor é então otimizado pela sintonia da óptica de íon. Uma vez feito, o alvo é isolado e o método de fragmentação é escolhido, como CID.
A força de uma tensão aplicada, que acelera o íon precursor na célula de colisão, afeta o grau de fragmentação. Esta tensão é aumentada até que o precursor esteja aproximadamente 10% de abundância em comparação com o íon mais alto do produto. Vários espectros são adquiridos e mediados até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada. O número de varreduras necessárias depende da intensidade do sinal do íon precursor original e pode variar de 3 a 300.
O analito neste exemplo, lipídio A de Escherichia coli K-12, tinha 19 fragmentos principais após CID. A estrutura geral do Lipid A é bem conhecida, permitindo que o software reconstrua a composição específica da amostra.
Agora que olhamos o procedimento, vamos ver algumas das maneiras que a espectrometria de massa é usada na bioquímica.
Um modo de varredura comum em espectrometria de massa em conjunto é o monitoramento de reação selecionado ou SRM. No SRM, ambos os analisadores em massa são fixados a uma relação de massa-carga selecionada, com foco em íons precursores e de produtos específicos. Devido ao alto grau de sensibilidade do SRM, os espectros de padrões de peptídeos de concentração conhecida podem ser utilizados e comparados com os das amostras desconhecidas, permitindo quantificar proteínas de interesse.
As proteínas são comumente modificadas após a tradução, tipicamente pela adição de grupos funcionais como grupos de metila, grupos de fosfato ou açúcares, conhecidos como glicanos. Estes são importantes nos processos de sinalização celular, elucidando como as células se comunicam entre si. Como a espectrometria de massa tandem fragmenta as proteínas em componentes menores, é possível determinar a localização do PTM para o fragmento específico ou mesmo um aminoácido. Algumas modificações, como acetilação e trimetilação, são difíceis de diferenciar apenas por massa, por isso a separação cromatografia é realizada antes da espectrometria de massa.
Muitos analitos no sangue do paciente são encontrados em concentrações abaixo do limite de detecção para espectrometria de massa típica. Outra vantagem do SRM é que ele descarta todos, exceto um íon de produto, aumentando a sensibilidade e aumentando o limite de detecção mais baixo em até 100 vezes. Neste exemplo, a droga imunossupressor, tacrolimus, poderia ser detectada a níveis de 1ng/mL.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa. Este vídeo descreveu a teoria do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e explicou algumas das maneiras que a técnica está sendo utilizada atualmente. Obrigado por assistir!
Procedure
Em conjunto espectrometria de massa, uma biomolécula de interesse é isolada de uma amostra biológica, e então fragmentada em múltiplas subunidades, a fim de ajudar a elucidar sua composição e sequência. Isso é feito por ter espectrômetros de massa em série. O primeiro espectrômetro ioniza uma amostra e filtrar íons de uma proporção de massa específica para carga. Os íons filtrados são então fragmentados e passados para um segundo espectrômetro de massa onde os fragmentos são analisados.
Este vídeo introduz os princípios da espectrometria de massa tandem, incluindo métodos de seleção em massa e dissociação. Também é mostrado um procedimento geral para analisar um composto bioquímico usando espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão. A seção de aplicações abrange monitoramento de reação de seleção, determinação de modificações de pós-tradução de proteínas e detecção de níveis de tacrolimus no sangue.
A espectrometria de massa tandem une múltiplos estágios de espectrometria de massa para primeiro isolar uma biomolécula e, em seguida, determinar aspectos de sua composição química. As biomoléculas possuem estruturas grandes e complexas, dificultando a determinação de sua composição molecular. A espectrometria de massa tandem seleciona uma molécula de interesse que é posteriormente fragmentada em múltiplas subunidades, o que pode ajudar a elucidar sua identificação e sequência. Este vídeo mostrará os conceitos de espectrometria de massa tandem, um procedimento geral, e alguns de seus usos na bioquímica.
A espectrometria de massa tandem começa como um instrumento típico de especificação de massa: com uma fonte de íons, que converte a amostra em íons, e um analisador de massa, que separa os íons com base em sua relação massa-carga. Um analisador de massa comum, o quadrupole, só permite íons com uma proporção específica através, enquanto os outros batem nas hastes do aparelho. A espécie permitida, chamada íon precursor, é a biomolécula de interesse. O íon se move para uma célula de colisão, tipicamente outro quadrúpole, onde a energia é aplicada para fragmentar o íon em um padrão previsível.
Esses fragmentos se movem para outro analisador em massa, como um tempo de voo, que separa esses "íons de produto". Os íons do produto são então enviados para o detector, como em um instrumento normal de MS. No caso de uma proteína desconhecida, o espectro resultante contém numerosos fragmentos sobrepostos, tornando difícil de gerar uma sequência completa definitiva da biomolécula. No entanto, o padrão espectral é único para uma determinada proteína. O software de análise compara o espectro a um banco de dados de sequências de peptídeos conhecidos, elucidando a proteína desconhecida dos fragmentos sobrepostos.
Dependendo da amostra e do grau desejado de fragmentação, são possíveis múltiplos métodos de fragmentação. Os padrões de fragmentação dependem de como a energia é transferida, sua quantidade e como ela é distribuída através do íon precursor. A energia pode ser transferida através de partículas neutras, radiação ou elétrons. Usando átomos neutros, um processo chamado dissociação induzida por colisão ou CID, principalmente se inclina na ligação peptídeo entre os aminoácidos, ideal para sua identificação.
Agora que o básico da técnica foi coberto, vamos olhar para a espectrometria de massa de CID tandem sendo usada para estudar um componente de envelopes de células bacterianas.
Como em todos os experimentos espectrométricos de massa, o primeiro passo é ionizar a amostra. Para biomoléculas, isso é tipicamente feito com desagrecção assistida por laser matricial ou ionização eletrospray. O sinal de íon precursor é então otimizado pela sintonia da óptica de íon. Uma vez feito, o alvo é isolado e o método de fragmentação é escolhido, como CID.
A força de uma tensão aplicada, que acelera o íon precursor na célula de colisão, afeta o grau de fragmentação. Esta tensão é aumentada até que o precursor esteja aproximadamente 10% de abundância em comparação com o íon mais alto do produto. Vários espectros são adquiridos e mediados até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada. O número de varreduras necessárias depende da intensidade do sinal do íon precursor original e pode variar de 3 a 300.
O analito neste exemplo, lipídio A de Escherichia coli K-12, tinha 19 fragmentos principais após CID. A estrutura geral do Lipid A é bem conhecida, permitindo que o software reconstrua a composição específica da amostra.
Agora que olhamos o procedimento, vamos ver algumas das maneiras que a espectrometria de massa é usada na bioquímica.
Um modo de varredura comum em espectrometria de massa em conjunto é o monitoramento de reação selecionado ou SRM. No SRM, ambos os analisadores em massa são fixados a uma relação de massa-carga selecionada, com foco em íons precursores e de produtos específicos. Devido ao alto grau de sensibilidade do SRM, os espectros de padrões de peptídeos de concentração conhecida podem ser utilizados e comparados com os das amostras desconhecidas, permitindo quantificar proteínas de interesse.
As proteínas são comumente modificadas após a tradução, tipicamente pela adição de grupos funcionais como grupos de metila, grupos de fosfato ou açúcares, conhecidos como glicanos. Estes são importantes nos processos de sinalização celular, elucidando como as células se comunicam entre si. Como a espectrometria de massa tandem fragmenta as proteínas em componentes menores, é possível determinar a localização do PTM para o fragmento específico ou mesmo um aminoácido. Algumas modificações, como acetilação e trimetilação, são difíceis de diferenciar apenas por massa, por isso a separação cromatografia é realizada antes da espectrometria de massa.
Muitos analitos no sangue do paciente são encontrados em concentrações abaixo do limite de detecção para espectrometria de massa típica. Outra vantagem do SRM é que ele descarta todos, exceto um íon de produto, aumentando a sensibilidade e aumentando o limite de detecção mais baixo em até 100 vezes. Neste exemplo, a droga imunossupressor, tacrolimus, poderia ser detectada a níveis de 1ng/mL.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa. Este vídeo descreveu a teoria do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e explicou algumas das maneiras que a técnica está sendo utilizada atualmente. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
