Overview
A cinética enzimática descreve os efeitos catalíticos das enzimas, que são biomoléculas que facilitam reações químicas necessárias para organismos vivos. Enzimas atuam em moléculas, conhecidas como substratos, para formar produtos. Os parâmetros cinéticos enzimáticos são determinados através de ensaios que medem direta ou indiretamente mudanças no substrato ou concentração do produto ao longo do tempo.
Este vídeo abordará os princípios básicos da cinética enzimática (incluindo equações de taxa) e modelos cinéticos. Os conceitos que regem os ensaios enzimáticos também são discutidos, seguidos por um típico ensaio colorimétrico. A seção de aplicações discute um ensaio enzimático via análise de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), caracterizando atividade enzimática extracelular no ambiente e investigando cinética de reparo de DNA usando sondas moleculares.
Enzimas são catalisadores bioquímicos essenciais para a vida. Ensaios enzimáticos são usados para estudar as propriedades cinéticas das reações enzimáticas, elucidando os efeitos catalíticos das enzimas. Este vídeo cobrirá cinética e ensaios enzimáticos, passará por um procedimento geral e mostrará algumas aplicações.
Enzimas são proteínas, ou menos frequentemente RNAs, que agem em um reagente específico, referido como o substrato. Uma enzima reduz a energia de ativação necessária para iniciar uma reação bioquímica, fazendo com que a reação ocorra em uma velocidade mais rápida.
Reações enzimáticas podem ser divididas em três componentes elementares. A primeira é a formação do complexo enzimá-substrato, formado pela ligação do substrato ao local ativo da enzima. O complexo pode se decompor em seus constituintes originais. Esta é a segunda reação elementar. Alternativamente, o complexo pode formar o produto e recuperar a enzima, a terceira reação elementar.
A cinética de uma reação elementar é dada pela equação da lei de taxa elementar. Equações de lei de taxas dão a taxa em termos de concentração dos reagentes e uma taxa constante. Cada uma das reações elementares tem uma equação de lei de taxa individual, com sua própria constante taxa. Estas equações podem ser destiladas até um modelo cinético conhecido como equação de Michaelis-Menten. Isso dá a taxa de reação em termos de concentração de substrato; que pode ser experimentalmente determinado. Algumas tendências gerais para reações enzimáticas podem ser identificadas usando a equação de Michaelis-Menten. Na alta concentração de substratos, um ponto de saturação é atingido, chamado Vmax. Aqui, a taxa é limitada pela concentração total da enzima, e o número de moléculas de substrato que uma enzima converte em produto por determinado tempo, também conhecido comok cat. Em Michaelis-Menten cinética kgato é uma das duas constantes que governam a taxa de reação. A outra constante, KM, é conhecida como a constante de afinidade. KM também é equivalente à concentração onde a taxa de reação é equivalente a meio Vno máximo . Uma enzima com maior afinidade terá um KM mais baixo e atingirá vmax mais rápido, enquanto uma enzima com menor afinidade terá um KM mais alto e levará mais tempo para chegar aoV max. Conhecer kgato e KM permite que enzimas sejam comparadas. Para fazer isso, usamos uma proporção chamada eficiência enzimápica. Gatok mais alto e KM inferior resultam em maior eficiência, enquantok cat inferior e km mais alto resulta em menor.
Os fatores utilizados para elucidar cinética enzimática devem ser determinados experimentalmente. Esses ensaios são tipicamente realizados misturando uma solução enzimático e substrato em um ambiente controlado. Observações são feitas medindo as mudanças na concentração do substrato, produto ou subprodutos em relação ao tempo.
A mudança de concentração ao longo do tempo é usada para determinar a taxa de reação. Para determinar a cinética, os dados de taxa devem ser obtidos em múltiplas concentrações. Se um enredo da taxa inicial inversa vs. concentração inicial inversa, conhecida como o enredo lineweaver-Burk, é linear, então a reação segue a cinética de Michaelis-Menten. A inclinação e a interceptação da linha permitem a determinação dos parâmetros cinéticos KM e Vmax,que podem então ser usados para calcular kgato e a eficiência da enzima.
Agora que os princípios da cinética enzimática foram discutidos, vamos ver como um ensaio típico de enzimas é realizado.
Neste procedimento é demonstrado um ensaio colorimétrico. O primeiro passo é gerar uma curva padrão, que irá correlacionar a absorção com a concentração de substrato. Soluções de concentração conhecida são preparadas juntamente com uma amostra de controle. Uma solução de desenvolvedor que reage com o substrato é adicionada para produzir um composto colorido. A absorvência é medida e plotada contra a concentração para gerar a curva padrão.
Para realizar o ensaio, uma concentração conhecida de substrato é preparada juntamente com a quantidade apropriada de enzima. A enzima e o substrato são misturados e permitidos incubar por um intervalo de tempo definido. pH e temperatura são controladas com soluções tampão e blocos de aquecimento. Um agente saciado é adicionado para parar a reação. A solução do desenvolvedor é então adicionada às reações e misturadas. As soluções são então colocadas em cuvetas e a absorção é medida. A quantidade de substrato consumido é determinada comparando a absorvância medida com a curva padrão. Usando os dados coletados, as taxas iniciais de reação são determinadas por traçar a concentração ao longo do tempo. Finalmente, com os dados de taxa e concentração, a trama de Michaelis-Menten é feita. Isso permite a determinação de propriedades cinéticas para a enzima, como número de rotatividade e eficiência enzimática.
Agora que revisamos um procedimento de ensaio, vamos ver outras maneiras de os ensaios serem realizados e suas aplicações.
Neste procedimento, a análise fret é usada para estudar a cinética de uma protease hidrolise de uma ligação peptídea de uma proteína. Essas emissões podem ser medidas, permitindo uma análise contínua e quantitativa do consumo e produção de substratos, auxiliando na determinação da cinética de reação.
Ensaios enzimáticos podem ser usados em ciência ambiental para determinar os níveis de atividade enzimular extracelular no ambiente. Águas, solos e sedimentos podem ser coletados do meio ambiente e processados em laboratório. A atividade enzimática extracelular desses materiais pode então ser caracterizada por ensaios enzimáticos. Esta é uma ferramenta útil para entender como o ambiente processa material orgânico.
O mecanismo de reparação de DNA de uma célula pode ser avaliado estudando a cinética das enzimas encontradas no núcleo. A taxa na qual uma enzima remove lesões de DNA, ou danos, pode ser medida usando sinalizadores moleculares fluorescentes, que só fluorescem quando ligados a sequências de DNA únicas. O nível de reparação do DNA pode ser medido em tempo real, detectando os produtos de decote fluorescente rotulados.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre cinética enzimática. Este vídeo explicou cinética enzimática, cobriu conceitos de ensaio, passou por um procedimento geral e descreveu algumas aplicações.
Obrigado por assistir!
Procedure
A cinética enzimática descreve os efeitos catalíticos das enzimas, que são biomoléculas que facilitam reações químicas necessárias para organismos vivos. Enzimas atuam em moléculas, conhecidas como substratos, para formar produtos. Os parâmetros cinéticos enzimáticos são determinados através de ensaios que medem direta ou indiretamente mudanças no substrato ou concentração do produto ao longo do tempo.
Este vídeo abordará os princípios básicos da cinética enzimática (incluindo equações de taxa) e modelos cinéticos. Os conceitos que regem os ensaios enzimáticos também são discutidos, seguidos por um típico ensaio colorimétrico. A seção de aplicações discute um ensaio enzimático via análise de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), caracterizando atividade enzimática extracelular no ambiente e investigando cinética de reparo de DNA usando sondas moleculares.
Enzimas são catalisadores bioquímicos essenciais para a vida. Ensaios enzimáticos são usados para estudar as propriedades cinéticas das reações enzimáticas, elucidando os efeitos catalíticos das enzimas. Este vídeo cobrirá cinética e ensaios enzimáticos, passará por um procedimento geral e mostrará algumas aplicações.
Enzimas são proteínas, ou menos frequentemente RNAs, que agem em um reagente específico, referido como o substrato. Uma enzima reduz a energia de ativação necessária para iniciar uma reação bioquímica, fazendo com que a reação ocorra em uma velocidade mais rápida.
Reações enzimáticas podem ser divididas em três componentes elementares. A primeira é a formação do complexo enzimá-substrato, formado pela ligação do substrato ao local ativo da enzima. O complexo pode se decompor em seus constituintes originais. Esta é a segunda reação elementar. Alternativamente, o complexo pode formar o produto e recuperar a enzima, a terceira reação elementar.
A cinética de uma reação elementar é dada pela equação da lei de taxa elementar. Equações de lei de taxas dão a taxa em termos de concentração dos reagentes e uma taxa constante. Cada uma das reações elementares tem uma equação de lei de taxa individual, com sua própria constante taxa. Estas equações podem ser destiladas até um modelo cinético conhecido como equação de Michaelis-Menten. Isso dá a taxa de reação em termos de concentração de substrato; que pode ser experimentalmente determinado. Algumas tendências gerais para reações enzimáticas podem ser identificadas usando a equação de Michaelis-Menten. Em alta concentração de substrato, um ponto de saturação é atingido, chamado Vmax. Aqui, a taxa é limitada pela concentração total de enzimas, e o número de moléculas de substrato que uma enzima converte em produto por determinado tempo, também conhecido comok cat. Em Michaelis-Menten cinética kgato é uma das duas constantes que governam a taxa de reação. A outra constante, KM, é conhecida como a constante de afinidade. KM também é equivalente à concentração onde a taxa de reação é equivalente a meio Vno máximo . Uma enzima com maior afinidade terá um KM mais baixo e atingirá vmax mais rápido, enquanto uma enzima com menor afinidade terá um KM mais alto e levará mais tempo para chegar aoV max. Conhecer kgato e KM permite que enzimas sejam comparadas. Para fazer isso, usamos uma proporção chamada eficiência enzimápica. Gatok mais alto e KM inferior resultam em maior eficiência, enquantok cat inferior e km mais alto resulta em menor.
Os fatores utilizados para elucidar cinética enzimática devem ser determinados experimentalmente. Esses ensaios são tipicamente realizados misturando uma solução enzimático e substrato em um ambiente controlado. Observações são feitas medindo as mudanças na concentração do substrato, produto ou subprodutos em relação ao tempo.
A mudança de concentração ao longo do tempo é usada para determinar a taxa de reação. Para determinar a cinética, os dados de taxa devem ser obtidos em múltiplas concentrações. Se um enredo da taxa inicial inversa vs. concentração inicial inversa, conhecida como o enredo lineweaver-Burk, é linear, então a reação segue a cinética de Michaelis-Menten. A inclinação e a interceptação da linha permitem a determinação dos parâmetros cinéticos KM e Vmax,que podem então ser usados para calcular kgato e a eficiência da enzima.
Agora que os princípios da cinética enzimática foram discutidos, vamos ver como um ensaio típico de enzimas é realizado.
Neste procedimento é demonstrado um ensaio colorimétrico. O primeiro passo é gerar uma curva padrão, que irá correlacionar a absorção com a concentração de substrato. Soluções de concentração conhecida são preparadas juntamente com uma amostra de controle. Uma solução de desenvolvedor que reage com o substrato é adicionada para produzir um composto colorido. A absorvência é medida e plotada contra a concentração para gerar a curva padrão.
Para realizar o ensaio, uma concentração conhecida de substrato é preparada juntamente com a quantidade apropriada de enzima. A enzima e o substrato são misturados e permitidos incubar por um intervalo de tempo definido. pH e temperatura são controladas com soluções tampão e blocos de aquecimento. Um agente saciado é adicionado para parar a reação. A solução do desenvolvedor é então adicionada às reações e misturadas. As soluções são então colocadas em cuvetas e a absorção é medida. A quantidade de substrato consumido é determinada comparando a absorvância medida com a curva padrão. Usando os dados coletados, as taxas iniciais de reação são determinadas por traçar a concentração ao longo do tempo. Finalmente, com os dados de taxa e concentração, a trama de Michaelis-Menten é feita. Isso permite a determinação de propriedades cinéticas para a enzima, como número de rotatividade e eficiência enzimática.
Agora que revisamos um procedimento de ensaio, vamos ver outras maneiras de os ensaios serem realizados e suas aplicações.
Neste procedimento, a análise fret é usada para estudar a cinética de uma protease hidrolise de uma ligação peptídea de uma proteína. Essas emissões podem ser medidas, permitindo uma análise contínua e quantitativa do consumo e produção de substratos, auxiliando na determinação da cinética de reação.
Ensaios enzimáticos podem ser usados em ciência ambiental para determinar os níveis de atividade enzimular extracelular no ambiente. Águas, solos e sedimentos podem ser coletados do meio ambiente e processados em laboratório. A atividade enzimática extracelular desses materiais pode então ser caracterizada por ensaios enzimáticos. Esta é uma ferramenta útil para entender como o ambiente processa material orgânico.
O mecanismo de reparação de DNA de uma célula pode ser avaliado estudando a cinética das enzimas encontradas no núcleo. A taxa na qual uma enzima remove lesões de DNA, ou danos, pode ser medida usando sinalizadores moleculares fluorescentes, que só fluorescem quando ligados a sequências de DNA únicas. O nível de reparação do DNA pode ser medido em tempo real, detectando os produtos de decote fluorescente rotulados.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre cinética enzimática. Este vídeo explicou cinética enzimática, cobriu conceitos de ensaio, passou por um procedimento geral e descreveu algumas aplicações.
Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
