Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Ressonância de Plasmon superficial (SPR)
 
Click here for the English version

Ressonância de Plasmon superficial (SPR)

Overview

A ressonância de plasmon superficial (SPR) é o fenômeno óptico subjacente por trás de biosensores livres de rótulos para avaliar a afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração de biomoléculas. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um biosensor feito de uma fina camada de metal em um prisma. As interações em tempo real das biomoléculas podem ser monitoradas medindo as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal.

Este vídeo descreve os conceitos básicos da RSE e como ele é usado para analisar e visualizar interações biomoleculares. Isso é seguido por uma preparação amostral e um protocolo experimental para investigar taxas vinculantes usando SPR. Na seção de aplicações, imagens SPR, SPR localizada e SPR aprimorada de ponto quântico são explorados.

A ressonância de plasmon superficial, ou SPR, é o fenômeno subjacente por trás de certos biosensores livres de rótulos para avaliar interações de vinculação e adsorção de biomoléculas. Ensaios de vinculação que requerem rotulagem, como o ELISA, podem ser um processo demorado, podendo alterar a funcionalidade do analito. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um sensor especial feito de uma fina camada de metal em uma face de um prisma. Ao monitorar as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal, os instrumentos SPR visualizam essas interações em tempo real sem o uso de etiquetas. Este vídeo introduzirá os princípios da SPR, um procedimento geral para imagem SPR, e algumas aplicações de na bioquímica.

Um sensor SPR é geralmente feito de uma fina camada de um metal nobre em cima da face de um prisma. Para tirar leituras do sensor, a luz é refletida fora da interface prisma-metal em um fotodetetor. A luz refletida terá uma alta intensidade, exceto em um certo ângulo, relacionada às propriedades eletrônicas da superfície metálica, conhecida como "ângulo de ressonância plasmon superficial".

À medida que as moléculas se ligam à superfície, as propriedades eletrônicas do metal mudam, o que por sua vez ajusta o ângulo. À medida que novas proteínas se anexam, formando complexos, o ângulo mudará ainda mais. Medindo mudanças relativas no ângulo SPR, interações como essas podem ser monitoradas em tempo real.

Outra técnica chamada localização, ou "L"SPR, usa nanopartículas metálicas como superfície do sensor. As propriedades que afetam o ângulo SPR são altamente localizadas a cada nanopartícula, o que melhora a sensibilidade e a resolução do sinal.

Ao investigar interações de ligação com o SPR padrão, o sensor é geralmente montado em uma plataforma que se torna o chão de uma célula de fluxo no instrumento. As biomoléculas de interesse são transportadas através da célula de fluxo por solução tampão. A superfície do sensor é frequentemente revestida pela primeira vez com um substrato que tem uma alta afinidade com o metal. Isso garante que uma quantidade significativa de ligante, que por sua vez se liga ao analito de interesse, será imobilizada no sensor e reduz a probabilidade de que o ligante se dissociará durante o procedimento.

Uma vez que o ligante é imobilizado no sensor, o analito é fluído sobre o sensor em buffer. Monitorando a alteração no ângulo SPR ao longo do tempo à medida que o analito se liga ao ligante, a taxa de vinculação e outras informações cinéticas podem ser calculadas.

Os dados de reflectância também podem ser usados para imagens spr, ou SPRi, direcionando a luz refletida para um detector de CCD. Isso produz uma imagem de alto contraste e alta resolução de toda a superfície do sensor. Utilizando SPR e as técnicas relacionadas, as perguntas podem ser respondidas sobre afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração.

Agora que você entende o que está sendo medido em um experimento spr, vamos olhar para um procedimento para investigar taxas vinculantes.

Antes de iniciar o procedimento, os buffers de corrida e amostra devem ser preparados. O buffer de execução é usado para depositar o ligante no sensor, e o buffer de amostra é usado para depositar o analito. O chip do sensor é cuidadosamente limpo e carregado em uma baia. Em seguida, o dispositivo é colocado no instrumento, onde se torna a parte inferior da célula de fluxo. O software de instrumentos está configurado para o experimento e análise subsequente. Se necessário, a superfície do sensor é preparada com um substrato para capturar o ligante. O ligante é fluído sobre a superfície do sensor no buffer de corrida, onde é capturado pelo substrato na superfície do sensor.

Em seguida, o analito no tampão amostral é executado através da célula de fluxo, onde se liga seletivamente ao ligante imobilizado. A mudança na reflexão é plotada e comparada com os controles para determinar as constantes de taxa e outros dados de cinética de reação para a reação investigada.

Agora que você entende como um experimento SPR é realizado, vamos olhar para algumas outras aplicações de SPR em bioquímica.

Aqui, a imagem SPR foi utilizada para avaliar proteínas com uma matriz de onze receptores em um sensor. Gráficos 3D de reflexividade versus tempo e concentração receptora foram preparados a partir dos dados de reflexividade de cada proteína. Esses "perfis" são característicos de cada proteína e, portanto, poderiam ser posteriormente utilizados para identificação de proteínas.

Neste experimento, secreções celulares foram estudadas usando um sensor LSPR personalizado. O sensor também era compatível com SPRi e microscopia de fluorescência. Ao depositar a célula no sensor, a interação das secreções celulares com a matriz de nanopartículas poderia ser medida com alta resolução espacial.

Aqui, foi investigado o uso de pontos quânticos, semicondutores nanoescala, como agente de aprimoramento de sinal SPR misturado com o analito. Este método aprimorado "nano-SPRi" foi comparado aos ensaios do SPRi padrão e do método ELISA. O método nano-SPRi melhorou significativamente a sensibilidade e o limite de detecção, sendo ainda menos demorado do que o método ELISA.

Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre ressonância de plasmon superficial. Este fenômeno é usado para monitorar e imagem de interações biomoleculares sem o uso de rótulos. Este vídeo introduziu os princípios do SPR, um protocolo típico para a realização de um experimento spr, e algumas aplicações de SPR em bioquímica.

Obrigado por assistir!

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A ressonância de plasmon superficial (SPR) é o fenômeno óptico subjacente por trás de biosensores livres de rótulos para avaliar a afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração de biomoléculas. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um biosensor feito de uma fina camada de metal em um prisma. As interações em tempo real das biomoléculas podem ser monitoradas medindo as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal.

Este vídeo descreve os conceitos básicos da RSE e como ele é usado para analisar e visualizar interações biomoleculares. Isso é seguido por uma preparação amostral e um protocolo experimental para investigar taxas vinculantes usando SPR. Na seção de aplicações, imagens SPR, SPR localizada e SPR aprimorada de ponto quântico são explorados.

A ressonância de plasmon superficial, ou SPR, é o fenômeno subjacente por trás de certos biosensores livres de rótulos para avaliar interações de vinculação e adsorção de biomoléculas. Ensaios de vinculação que requerem rotulagem, como o ELISA, podem ser um processo demorado, podendo alterar a funcionalidade do analito. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um sensor especial feito de uma fina camada de metal em uma face de um prisma. Ao monitorar as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal, os instrumentos SPR visualizam essas interações em tempo real sem o uso de etiquetas. Este vídeo introduzirá os princípios da SPR, um procedimento geral para imagem SPR, e algumas aplicações de na bioquímica.

Um sensor SPR é geralmente feito de uma fina camada de um metal nobre em cima da face de um prisma. Para tirar leituras do sensor, a luz é refletida fora da interface prisma-metal em um fotodetetor. A luz refletida terá uma alta intensidade, exceto em um certo ângulo, relacionada às propriedades eletrônicas da superfície metálica, conhecida como "ângulo de ressonância plasmon superficial".

À medida que as moléculas se ligam à superfície, as propriedades eletrônicas do metal mudam, o que por sua vez ajusta o ângulo. À medida que novas proteínas se anexam, formando complexos, o ângulo mudará ainda mais. Medindo mudanças relativas no ângulo SPR, interações como essas podem ser monitoradas em tempo real.

Outra técnica chamada localização, ou "L"SPR, usa nanopartículas metálicas como superfície do sensor. As propriedades que afetam o ângulo SPR são altamente localizadas a cada nanopartícula, o que melhora a sensibilidade e a resolução do sinal.

Ao investigar interações de ligação com o SPR padrão, o sensor é geralmente montado em uma plataforma que se torna o chão de uma célula de fluxo no instrumento. As biomoléculas de interesse são transportadas através da célula de fluxo por solução tampão. A superfície do sensor é frequentemente revestida pela primeira vez com um substrato que tem uma alta afinidade com o metal. Isso garante que uma quantidade significativa de ligante, que por sua vez se liga ao analito de interesse, será imobilizada no sensor e reduz a probabilidade de que o ligante se dissociará durante o procedimento.

Uma vez que o ligante é imobilizado no sensor, o analito é fluído sobre o sensor em buffer. Monitorando a alteração no ângulo SPR ao longo do tempo à medida que o analito se liga ao ligante, a taxa de vinculação e outras informações cinéticas podem ser calculadas.

Os dados de reflectância também podem ser usados para imagens spr, ou SPRi, direcionando a luz refletida para um detector de CCD. Isso produz uma imagem de alto contraste e alta resolução de toda a superfície do sensor. Utilizando SPR e as técnicas relacionadas, as perguntas podem ser respondidas sobre afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração.

Agora que você entende o que está sendo medido em um experimento spr, vamos olhar para um procedimento para investigar taxas vinculantes.

Antes de iniciar o procedimento, os buffers de corrida e amostra devem ser preparados. O buffer de execução é usado para depositar o ligante no sensor, e o buffer de amostra é usado para depositar o analito. O chip do sensor é cuidadosamente limpo e carregado em uma baia. Em seguida, o dispositivo é colocado no instrumento, onde se torna a parte inferior da célula de fluxo. O software de instrumentos está configurado para o experimento e análise subsequente. Se necessário, a superfície do sensor é preparada com um substrato para capturar o ligante. O ligante é fluído sobre a superfície do sensor no buffer de corrida, onde é capturado pelo substrato na superfície do sensor.

Em seguida, o analito no tampão amostral é executado através da célula de fluxo, onde se liga seletivamente ao ligante imobilizado. A mudança na reflexão é plotada e comparada com os controles para determinar as constantes de taxa e outros dados de cinética de reação para a reação investigada.

Agora que você entende como um experimento SPR é realizado, vamos olhar para algumas outras aplicações de SPR em bioquímica.

Aqui, a imagem SPR foi utilizada para avaliar proteínas com uma matriz de onze receptores em um sensor. Gráficos 3D de reflexividade versus tempo e concentração receptora foram preparados a partir dos dados de reflexividade de cada proteína. Esses "perfis" são característicos de cada proteína e, portanto, poderiam ser posteriormente utilizados para identificação de proteínas.

Neste experimento, secreções celulares foram estudadas usando um sensor LSPR personalizado. O sensor também era compatível com SPRi e microscopia de fluorescência. Ao depositar a célula no sensor, a interação das secreções celulares com a matriz de nanopartículas poderia ser medida com alta resolução espacial.

Aqui, foi investigado o uso de pontos quânticos, semicondutores nanoescala, como agente de aprimoramento de sinal SPR misturado com o analito. Este método aprimorado "nano-SPRi" foi comparado aos ensaios do SPRi padrão e do método ELISA. O método nano-SPRi melhorou significativamente a sensibilidade e o limite de detecção, sendo ainda menos demorado do que o método ELISA.

Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre ressonância de plasmon superficial. Este fenômeno é usado para monitorar e imagem de interações biomoleculares sem o uso de rótulos. Este vídeo introduziu os princípios do SPR, um protocolo típico para a realização de um experimento spr, e algumas aplicações de SPR em bioquímica.

Obrigado por assistir!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nenhum conflito de interesses declarado.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter