Transferência de energia por ressonância Förster (FRET)
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Overview
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno usado para investigar interações bioquímicas de perto. Na FRET, uma molécula fotoluminescente do doador pode transferir energia não radiativamente para uma molécula aceitadora se seus respectivos espectros de emissão e absorção se sobreporem. A quantidade de energia transferida — e, consequentemente, a emissão global da amostra — depende da proximidade de um par de moléculas fotoluminescentes aceitadoras e doadoras. A análise do FRET é combinada com outras técnicas de bioquímica para obter informações detalhadas de estruturas biomoleculares e interações a partir desta “régua espectroscópica”.
Este vídeo abrange os princípios e conceitos da análise fret. O procedimento se concentra na preparação de amostras para fret e formas de apresentar e interpretar dados. Finalmente, as aplicações incluem monitorar processos conformais e celulares rotulando partes de uma célula ou proteína, monitorando reações enzimáticas que alteram estruturas proteicas e usando FRET para monitorar a agregação de monômeros expressos pelas células.
Förster Resonance Energy Transfer, ou FRET, é uma transferência não radiativa de energia entre moléculas emissoras de luz, e é frequentemente usada para investigar interações bioquímicas de perto. O FRET só ocorre quando moléculas fluorescentes são espaçadas dentro de 10 nm uma da outra. A análise do FRET pode ser combinada com outras técnicas para obter informações estruturais detalhadas. Este vídeo introduzirá os princípios subjacentes do FRET, resumirá um protocolo e apresentação de dados e discutirá algumas aplicações bioquímicas.
Uma molécula fotoluminescente como um fluoróforo é animada por absorver radiação eletromagnética em um comprimento de onda em seu espectro de absorção. À medida que relaxa, emite luz em um comprimento de onda dentro de seu espectro de emissões. Para obter mais informações sobre fluorescência, consulte o vídeo do JoVE sobre microscopia de fluorescência. Diferentes fluoroforos absorvem e emitem luz em diferentes comprimentos de onda, que frequentemente se sobrepõem. Se o espectro de emissões de um fluoróforo se sobrepor significativamente ao espectro de absorção de outro fluoróforo, o “doador” liberará um fóton virtual, que é absorvido pelo “aceitor”. Quando um doador excitado está a menos de 10 nm de um aceitador, a energia é transferida de doador para aceitador por interações dipolo-dipolo. A liberação de energia por emissão de luz do doador diminui correspondentemente. Enquanto isso, o aceitor animado emite luz em seu comprimento de onda de emissão. A resposta do FRET é avaliada em termos de eficiência, ou a porcentagem de energia liberada do doador pela FRET e não por fluorescência ou outros processos radiativos. A eficiência depende fortemente da distância entre o doador e o aceitador, o que permite que a FRET atue como uma régua ‘molecular’ ou ‘espectroscópica’.
Na bioquímica, o FRET é frequentemente usado qualitativamente para observar alterações conformais nas moléculas, monitorando fluoroforos à medida que se movem dentro e fora da faixa DE FRET umas das outras. Da mesma forma, as funções celulares podem ser estudadas com moléculas contendo um par DE FRET. Se a molécula rotulada for cortada pela atividade enzimática, o TRAS pára e o comprimento de onda de fluorescência observado muda.
Agora que você entende os princípios por trás da FRET, vamos olhar para uma visão geral de um protocolo e algumas maneiras de apresentar e interpretar os dados.
Antes do experimento, as biomoléculas de interesse, tipicamente DNA ou proteínas, são projetadas com etiquetas fluorescentes, usando técnicas de biologia molecular. Formas comuns de introduzir o material genético modificado nas células incluem transfecção e eletroporação.
Em seguida, as células são preparadas para visualização DE FRET em um microscópio de fluorescência. Por exemplo, as moléculas podem ser imobilizadas em um slide para fret de molécula única, ou as amostras são carregadas em poços para triagem de alto rendimento.
Em seguida, os lasers de excitação, microscópio e equipamentos associados são preparados. (A) Experimentos fret muitas vezes envolvem lasers poderosos; (B) para que sejam utilizados epis e procedimentos de segurança adequados. A amostra é então colocada no instrumento e iluminada com o laser de excitação.
Para experimentos que monitoram o comportamento celular, são utilizadas imagens coloridas mostrando diferenças ou alterações na intensidade de emissão. As intensidades de emissão de doadores e aceitadores são traçadas juntas para acompanhar a resposta do FRET ao longo do tempo.
Os dados fret também podem ser ajustados a várias funções para análises mais complexas. Dependendo do experimento, os dados podem ser apresentados de várias maneiras para melhor representar os resultados, tornando a FRET uma ferramenta experimental flexível.
Agora que você está familiarizado com o básico de executar e analisar um experimento FRET, vamos olhar para algumas aplicações de FRET em pesquisa de bioquímica.
O FRET pode ser usado para estudar alterações conformais ou processos celulares rotulando partes da proteína ou célula previstas para se mover dentro de 10 nm um do outro com um par DE FRET. Por exemplo, sensores de proteína são preparados rotulando receptores com um par de fluoroforos. A resposta FRET é monitorada ao vivo por microscopia confocal. A variação do comprimento de onda e intensidade da emissão indica alterações conformais.
O FRET também pode ser usado preparando moléculas com um par fret ativo e observando mudanças na resposta. Quando o substrato é cortado, o FRET é interrompido, causando um aumento na emissão de doadores e uma diminuição na emissão de aceitadores. As emissões são analisadas para determinar contribuições de doador, aceitador e FRET. Uma vez calculados os fatores de emissão direta para as proteínas fluorescentes ciano e amarela, a concentração e os parâmetros cinéticos do substrato podem ser determinados.
Células projetadas para expressar monômeros contendo qualquer um de um par DE FRET funcionam como “sensores” para interações entre esses monômeros. Se a agregação desses monômeros for induzida, uma resposta FRET é observada. Isso pode ser usado para investigar a agregação de proteínas desencadeada pela “semeadura” de proteínas desdobradas. Aqui, as células foram transduzidas com agregados da proteína de interesse, incubadas e analisadas com citometria de fluxo.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre Förster Resonance Energy Transfer, ou FRET. Este vídeo continha os princípios subjacentes do FRET, preparação e análise de um experimento FRET, e algumas aplicações bioquímicas.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.
A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.
In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.
Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.
Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.
Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.
Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.
For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.
FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.
Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.
FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.
FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.
Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.
You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.
Thanks for watching!
