Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Glioblastoma multiforme, erişkinlerde en sık görülen ve agresif primer beyin tümörü olmaya devam etmektedir. Cerrahiye dayalı agresif tedavilere ve ardından radyo ve kemoterapiye rağmen, GBM son derece kötü bir prognoz ve 15 aydan daha düşük bir medyan sağkalım ile ilişkilidir. Son on yılda çok az terapötik ilerleme kaydedildiğinden, hücresel immünoterapiler şu anda hızlı tümör nüksetmesinde rol oynayan yüksek invaziv ve dirençli GBM hücrelerini ortadan kaldırmak için araştırılmaktadır.

Tümör çevresinde seçilmiş GBM-reaktif sitotoksik immün faktörlerin uygulanması, doğrudan rezidüel malignite bölgesine konsantre hücresel immünoterapi vermek için eşsiz bir fırsat olabilir. Grubumuz yakın zamanda ortotopik primer insan GBM ksenogreft taşıyan immün yetmezlikli NSG farelerinin hastalarda GBM'yi daha fazla gelişme için özetlediğini göstermiştir. Bu GBM modelleri, sitotoksik immün efektörlerin intratümöral enjeksiyonlar üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı.

Bu protokol, öncelikle GBM-reaktif immün efektör hücrelerin izolasyonu ve amplifikasyonuna dayanan terapötik sürecimizi tanımlar. İkincisi, bu efektör hücrelerin interkraniyal enjeksiyon için çoğaltılması. Ve üçüncüsü, fare beynindeki tümör bölgesine stereotaktik enjeksiyonları.

Ortotopik enjeksiyondan sonra immün efektörün davranışı da araştırıldı. PHA fetüs stimülasyonundan üç hafta sonra, şişenin dibinde hücre kümesi oluşturan efektör hücreler dinlenme durumuna geri dönmüş ve kullanıma hazır olmalıdır. Efektör hücre sayısını kontrol ettikten sonra, hücreleri 115 mililitrelik tüpte yeniden askıya alın ve toplayın ve santrifüjleyin.

Bir süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Ve hücreleri steril PBS'de yeniden askıya alın ve yıkamak için santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın.

Ve sonra hücreleri bir mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Santrifüjleme için hücreleri bir mikrotüpe aktarın. Yine, yavaşça pipetleyerek süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın.

Bir sonraki adım kritiktir, steril PBS'nin son hacminin yarısındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve yumuşak ve dikkatli bir şekilde homojenize edin. Son hacmi mikropipet ile doğrulayın, fare başına son hacmin 20 milyon hücre için 15 ila 20 mikrolitre arasında olması gerekir. Fare başına 20 mikrolitreyi geçmeyeceğinden emin olun.

Enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun. Hayvanın bir ayak parmağı çimdiklemesiyle yeterince uyuşturulduğundan emin olun ve ardından kürkü ameliyat bölgesinden, iki kulak arasından ve buruna kadar çıkarın. Hücre topaklanmasını önlemek için hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve kabarcıkların varlığını önlemek için hücre süspansiyonunu büyük bir özenle şırıngaya yükleyin.

Ardından, şırıngayı uyarlanan şırınga pompasına yerleştirin. Ameliyat bölgesini tuz ve povidon iyot% 5 solüsyonu ile dezenfekte edin ve korneanın kurumasını önlemek için farenin gözlerine kayganlaştırıcı bir oftalmik merhem yerleştirin. Ardından, anestezi uygulanmış fareyi sıcak bir blok üzerindeki stereotaktik çerçeveye yerleştirin.

Farenin burnunu ve dişlerini diş çubuğunun üzerine uygun şekilde yerleştirin. Kafayı hareketsiz hale getirmek için kulak çubuklarını fare kulaklarına sıkıca sıkın. Kulak zarlarına zarar vermemeye, solunumu tehlikeye atmamaya ve başın iyi hareketsiz olduğundan emin olmaya dikkat edin.

Kafatasını ortaya çıkarmak için kafatasının üst kısmı boyunca steril makasla orta hat sagital cilt kesisi yapın. Stereotaktik lokalizasyon için yer işaretleri olarak hizmet etmek için sagital ve koronal yapıların kesişimini belirleyin ve şırıngayı bu noktanın üzerine yerleştirin. Şırıngayı önceden belirlenmiş koordinatlarda hareket ettirin.

İki milimetre sağ lateral ve 0,5 milimetre ön kısımda bir mikro matkap kullanarak, steril matkap ucuyla kafatasında küçük bir delik açın. Beyin hasarını önlemek için yüzeysel kalmaya dikkat edin. Şırıngayı delinmiş deliğe dikkatlice yerleştirin.

İğneyi dura içinde üç milimetre aşağı doğru yavaşça ileri doğru hareket ettirin ve ardından 0,5 milimetre geriye doğru 2,5 milimetre hücre enjeksiyonunun son derinliğine kadar hareket ettirin. Hücre enjeksiyonunu dakikada iki veya üç mikrolitre hızında çalıştırın ve fareleri enjeksiyon süresi boyunca izleyin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi sadece bir milimetre çekin ve infüzyon bölgesinden herhangi bir sızıntıyı önlemek için şırıngayı yavaşça tamamen çekmeden önce şırıngayı bir dakika daha yerinde tutun.

Hayvanı stereotaktik çerçeveden dikkatlice çıkarın. Cildi uygun cerrahi dikişle kapatın ve doğrudan yaranın üzerine% 2 Lidokain jeli uygulayın. Anesteziden tam iyileşme sağlanana kadar uygun fare vücut sıcaklığını korumak için anestezi uygulanmış fareyi 37 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtma yastığının üzerindeki ilgili kafesine aktarın.

Süspansiyon çok konsantre olduğundan, hücre canlılığı ve reaktivitesi kontrol edildi. Efektör hücreler in vivo enjeksiyonu taklit etmek için şırıngaya yüklendi. Hücreler hemen veya 10 dakika sonra toplandı ve propidium iyodür boyaması için akış sitometrisi ile analiz edildi.

Gördüğünüz gibi, hazırlık ve yükleme, efektör hücrelerin 24 saat sonra yaşayabilirliğini etkilemedi. Glioblastoma tümör hücrelerine karşı reaktivite, hazırlıksız hücreler veya hazırlanan efektörler kullanılarak da kontrol edildi ve gözlerde üç saat kaldı. Reaktivite, aktivasyon markörü CD107A'nın pozitif boyanması ile izlenir.

Bu sonuçlar, efektör hücrelerin reaktivitesinin preparattan etkilenmediğini göstermektedir. Efektör hücrelerin enjeksiyonundan yedi gün sonra, fare beyinleri toplandı, bölümlere ayrıldı ve tümör yapısının tanımlanmasına izin vermek için hematik renklenme için boyandı. Daha sonra anti-insan CD3 boyama, efektör hücrelerin lokalizasyonuna izin verdi.

İlginç bir şekilde, efektör hücreler tümörün etrafında ve tümör çekirdeğinde, aynı zamanda kontralateral hemisferde de bulundu. Enjeksiyondan 48 saat sonra fare beyninden izole edilen insan efektör T hücreleri, beyin hücrelerinin %2'sini temsil eder. Amplifikasyondan sonra% 99 saflık ile PHA, besleyiciler ve IL2 stimülasyonu varlığında hala çoğalabildiler.

Bu protokol sayesinde, dinlenen insan efektör hücreleri, stereotaksik enjeksiyonu takiben birkaç gün boyunca bir fare beyin parankimi ile hayatta kalabilir ve devriye gezebilir. Sonuç olarak, insan efektör hücrelerinin stereotaktik enjeksiyonlarla adoptif transferi, sağlıklı hücreler üzerinde sınırlı zararlı etkileri olan infiltratif malign beyin tümörlerini etkili bir şekilde tedavi etmek için umut verici yaklaşımları temsil etmektedir. Bu uygulama yolu, insan hücrelerinin tümör bölgesine yakın bir şekilde iletilmesinden yararlanır ve dokular ve organizma içindeki seyreltmelerini sınırlar.

Burada, efektör hücreler üzerinde zararlı etkiler olmaksızın ve daha da önemlisi, fareler üzerinde gözle görülür herhangi bir zararlı etki olmaksızın beyin tümörü içinde büyük miktarda bağışıklık hücresinin verilmesini takip eden prosedürü tanımladık. Dahası, fare beynine lokal olarak enjekte edilen bağışıklık hücreleri sadece hayatta kalmak ve ex vivo olarak aktive edilme ve amplifiye edilme yeteneklerini korumakla kalmaz, aynı zamanda çevredeki beyin dokusundaki yayılmış tümör hücrelerini de ortadan kaldırır. Toplu olarak, bu özellikler, GBM tümörlerini karakterize eden güçlü infiltratif tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasına izin vermek için gereklidir.

Bu protokol, beyin tümörü model farelerde evlat edinme transfer prosedürünün kurulması için yeni bir fırsat sunmaktadır. Klinik CD'yi düşünmeden önce önemli bir adım.