Environment
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En anaerob Biosensor Assay til påvisning af kviksølv og Cadmium
Chapters
Summary December 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol for at bruge en anaerob hele-celle mikrobielle biosensor til at evaluere hvordan forskellige miljøvariabler påvirke biotilgængeligheden af Hg og Cd til bakterier i iltfattige miljøer.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål vedrørende biogeokemisk cykling af cadmium og kviksølv, såsom hvordan forskellige miljømæssige variabler påvirker deres biotilgængelighed for bakterier. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver kvasi realtid biotilgængelighed data og levedygtige celler uanset tilstedeværelsen af ilt. Generelt enkeltpersoner nye til denne metode vil kæmpe, fordi der er mange tidsfølsomme trin, der kræver meget omhyggelig opmærksomhed på detaljer.
Demonstration af proceduren vil være Ben, en grad studerende fra mit laboratorium. For at forberede analysen, hente kviksølv inducerende biosensor og konstituerende udtrykt biosensor fra et minus 80 grader Celsius cryo lager. Plade cellerne på lysogen bouillon plader, der indeholder 120 mikrogram pr. milliliter ampicillin.
Dyrk pladekulturerne i en kuvøse ved 37 grader Celsius natten over. Mellem 4:30 og 5 p.m. inokulere en kultur i ti milliliter LB med ampicillin og vokse natten over ved 37 grader Celsius med rystelser på 220 rpm.
På mellem ni og ti a.m næste morgen bringe kulturen samt den tidligere forberedte vækstmedium ind i anaerobe kammer. Derefter tilsættes otte milliliter frisk vækstmedium og 210 mikrogram pr. milliliter ampicillin i et sterilt balchrør.
Nu indsamle to milliliter af natten dyrket kultur og overføre til en to milliliter mikrocentrifuge rør. Efter centrifugering ved 10,000 RCF i 90 sekunder fjernes supernatanten og resuspendres i to milliliter frisk vækstmedium. Derefter tilsættes den resuspenderede kultur til balch røret indeholder otte milliliter frisk vækst medium og ampicillin.
Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret, før du fjerner det fra det anaerobe kammer. Derefter placere røret i en kuvøse og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med omrystning ved 220 rpm. Mellem tre og fem p.m.
bringe balch rør med kulturen, en ny steril balch rør, og vækstmediet ind i anaerobe kammer. Tilsæt 100 mikroliter af kulturen til 10 milliliter frisk vækstmed ampicillin i det sterile balchrør. Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret.
Fjern røret fra det anaerobe kammer, før du dyrker det natten over ved 37 grader Celsius med rystelser ved 220 rpm. Mellem ni og ti a.m. den næste dag, overføre kultur og vækstmediet tilbage til det anaerobe kammer.
Igen tilføje otte milliliter vækst medium og ampicillin i en steril balch rør. Overfør to milliliter af den dyrkede kultur natten over til et to milliliter mikrocentrifugerør. Efter centrifugering som før fjernes supernatanten og cellerne opsbruges igen i to milliliter frisk vækstmedium.
Tilsæt derefter den resuspenderede kultur til balchrøret, der indeholder det friske vækstmedium og ampicillin. Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret. Fjern det fra kammeret og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med omrystning på 220 rpm.
Overvåg kulturens vækst ved hjælp af et spektrofotometer ved at vortexing kulturen og derefter måle den optiske tæthed ved 600 nanometer eller OD600. Efter tre til fire timers forventet vækst, bør kulturen nå en OD600 af 6. Nu bringe røret i det anaerobe kammer og overføre kulturen i to to milliliter mikrocentrifuge rør.
Efter centrifugering som før fjernes supernatant og resuspendere hver celle gane i to milliliter frisk eksponering medium. Gentag dette vasketrin én gang for at fjerne ethvert spor af vækstmediet. Nu kombinere både mikro centrifuge rør af cellekultur i en syv milliliter PTFE standard hætteglas for at opnå biosensor lager til brug i eksponeringsanalyse.
Før forsøget påbegyndes, skal den anaerobe monitor kontrolleres for at sikre, at der ikke er ilt i det anaerobe kammer. Design pladen layout i henhold til en 96 godt skabelon. For at køre forsøg med tekniske replikater af tre vil dette give mulighed for 32 forskellige behandlinger, som bedst repræsenteres med en fire af otte gitter til at oprette hætteglas.
Opsæt de fire med otte gitter i henhold til analysen plade layout. Læg derefter syv milliliter PTFE standard hætteglas i bakken. Hætteglas bør kun håndteres ved at manipulere ydersiden af hætteglasset.
Der tilsættes eksponeringsmediummængden i hvert hætteglas, der svarer til hver behandling. Til hvert hætteglas tilsættes det tilsvarende volumen af den kemiske variabel, der skal testes i henhold til pladelayoutet. Nu tilsættes nitrat til hvert hætteglas, så koncentrationen er 200 mikromolar.
Udeluk dette trin for konstituerende biosensor behandling emner. For at tilføje kviksølv til hætteglassene, først tage de fire til otte mikromolar bestand og ryst godt. Opløsningen og eksponeringsmediet fortyndes i et PTFE-hætteglas med syv milliliter til en koncentration på 100 til 250 nanomolar for at lave en fungerende kviksølvopløsning.
Fra denne arbejdsløsning tilsættes kviksølv til de nødvendige hætteglas i henhold til pladelayoutet. Efter tilsætning af kviksølv eller cadmium manuelt ryste pladen i en orbital bevægelse. Forsøget kan sættes på pause nu afhængigt af den tid, det er nødvendigt for, at kviksølv eller cadmium kan speciaate i opløsning.
Når forsøget genoptages, pipetteres biosensorbestanden forsigtigt frem og tilbage for at sikre homogenitet. Derefter tilsættes 100 mikroliter af biosensorlageret til hvert hætteglas og ryst forsigtigt pladen som før. Varm pladelæseren op til 37 grader Celsius og opsæt et kinetisk løb i ti timer med aflæsninger hvert andet punkt fem til fem minutter.
En orbital ryster i mellem aflæsninger. Opsæt løbet til at tage fluorescensmålinger med en fluorescens-excitation på 440 nanometer og en emission på 500 nanometer. Nu pipette 200 mikroliter fra hver PTFE hætteglas i de fire med otte gitter i de tilsvarende brønde af 96 brøndpladen.
Pipette frem og tilbage fem gange, før hver 200 mikroliter overføres. I stedet for at kassere pipettespidsen skal pipettens tip efterlades i PTFE-hætteglasset for at holde styr på pipetteringsfremsk status. Placer 96 brøndpladen i bakken på pladelæseren.
Derefter placere låget på 96 godt plade og begynde analysen. Her er repræsentative resultater, der viser korrigerede fluorescensdata som en funktion af tid. Fluorescens er vist med stigende koncentrationer af kviksølv til den inducerende biosensor.
Alle værdier er tomme til ingen kviksølv kontrol. Lysstofrørets toppe kan kvantificeres for at vise fluorescerende signalet som en funktion af kviksølv- eller cadmiumkoncentrationen. For både de inducerende og de konstituerende biosensorer bør kviksølv- eller cadmiumkoncentrationen midt i det inducerede sensors lineære område anvendes til testvariabler.
Her er eksempler på et usikkert resultat med zink. Og et afgørende resultat med magnesium og mangan om kviksølv biotilgængelighed til biosensor. Resultatet med zink er ikke overbevisende, fordi den konstituerende fluorescens henfalder med inducerelig fluorescens, der indikerer toksicitet.
Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at indtaste koncentrationerne af enten cadmium eller kviksølv, da disse vil blive brugt til at kalibrere biosensoren. Efter denne procedure kan andre metoder som termodynamisk modellering af vandige systemer udføres for at besvare yderligere spørgsmål såsom hvordan påvirker specifikke kemiske arter af kviksølv eller cadmium deres biotilgængelighed. Glem ikke, at arbejde med cadmium og kviksølv og stærke syrer såsom svovlsyre kan være yderst farligt og forholdsregler såsom brug af personlige værnemidler bør altid tages, mens du udfører denne procedure.
Efter sin udvikling denne teknik banede vejen for forskere inden for miljømæssig mikrobiologi til at udforske kvasi realtid anaerob kviksølv eller cadmium biotilgængelighed og genetisk tractable mikrober.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
