पारा और कैडमियम का पता लगाने के लिए एक Anaerobicीय संवेदक परख

यह विधि कैडमियम और पारे के बायोजियोकेमिकल साइकिलिंग के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जैसे कि विभिन्न पर्यावरणीय चर बैक्टीरिया के लिए उनकी जैव उपलब्धता को कैसे प्रभावित करते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह ऑक्सीजन की उपस्थिति के बावजूद अर्ध वास्तविक समय जैव उपलब्धता डेटा और व्यवहार्य कोशिकाओं प्रदान करता है। आम तौर पर इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे क्योंकि कई बार संवेदनशील कदम हैं जिन्हें विस्तार पर बहुत सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है।

प्रक्रिया का प्रदर्शन बेन, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । परख के लिए तैयार करने के लिए, पारा प्रेरक बायोसेंसर को पुनः प्राप्त करें और संविलियन ने शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस क्रायो स्टॉक से बायोसेंसर व्यक्त किया। एम्पिसिलिन के 120 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त लिसोजेनी शोरबा प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।

रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में थाली संस्कृतियों बढ़ो । 4:30 और 5 पी के बीच.m एम्पिसिलिन के साथ पौंड के दस मिलीलीटर में एक संस्कृति टीका और २२० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने ।

नौ और दस के बीच में.m अगली सुबह संस्कृति के साथ ही पहले से तैयार विकास माध्यम को एनारोबिक चैंबर में लाते हैं। फिर एक बाँझ बाइच ट्यूब में नए विकास माध्यम के आठ मिलीलीटर और एम्पिसिलिन के मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर 210 माइक्रोग्राम जोड़ें।

अब रातोंरात उगाई गई संस्कृति के दो मिलीलीटर एकत्र करें और दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 90 सेकंड के लिए 10, 000 आरसीएफ पर अपकेंद्री के बाद, ताजा विकास माध्यम के दो मिलीलीटर में सुपरनेट और रीसस्लपेंड को हटा दें। फिर नए विकास माध्यम और एम्पिसिलिन के आठ मिलीलीटर युक्त बाल्च ट्यूब में पुनर्धारित संस्कृति जोड़ें।

बाँझ तकनीक का उपयोग करके, इसे एनारोबिक कक्ष से हटाने से पहले बाल्च ट्यूब पर रबर डाट को ध्यान से रखें। फिर ट्यूब को इनक्यूबेटर में रखें और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक रूप से विकसित करें। तीन से पांच पी .m के बीच।

संस्कृति के साथ बाल्च ट्यूब लाओ, एक नया बाँझ बाल्च ट्यूब, और विकास माध्यम अवायविक कक्ष में। बाँझ बाल्च ट्यूब में एम्पीसिलिन के साथ ताजा विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। बाँझ तकनीक का उपयोग करके, बाल्च ट्यूब पर एक रबर डाट सावधानी से रखें।

220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने से पहले एनारोबिक चैंबर से ट्यूब निकालें। अगले दिन नौ से दस ए .m के बीच, संस्कृति और विकास माध्यम को वापस एनारोबिक चैंबर में स्थानांतरित करें।

फिर से एक बाँझ बाच ट्यूब में विकास माध्यम और एम्पिसिलिन के आठ मिलीलीटर जोड़ें। रातोंरात उगाई गई संस्कृति के दो मिलीलीटर को दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पहले की तरह अपकेंद्री के बाद, सुपरनेट को हटा दें और कोशिकाओं को नए विकास माध्यम के दो मिलीलीटर में फिर से खर्च करें।

फिर ताजा विकास माध्यम और एम्पिसिलिन युक्त बाल्च ट्यूब में पुनर्निचित संस्कृति जोड़ें। बाँझ तकनीक का उपयोग करके, बाल्च ट्यूब पर एक रबर डाट सावधानी से रखें। इसे कक्ष से निकालें और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक रूप से बढ़ें।

संस्कृति को भंवर से जोड़कर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति के विकास की निगरानी करें और फिर 600 नैनोमीटर या OD600 पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए। तीन से चार घंटे की उम्मीद के विकास के बाद संस्कृति को 6 के OD600 तक पहुंचना चाहिए । अब ट्यूब को एनारोबिक चैंबर में लाएं और संस्कृति को दो दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

पहले के रूप में अपकेंद्रण के बाद सुपरनैटेंट को हटाने और ताजा जोखिम माध्यम के दो मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका तालु पुनः खर्च करते हैं । ग्रोथ मीडियम के किसी भी निशान को दूर करने के लिए इस वॉशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं। अब एक्सपोजर परख में उपयोग के लिए बायोसेंसर स्टॉक प्राप्त करने के लिए सेल संस्कृति के दोनों माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब्स को सात मिलीलीटर पीएफई मानक शीशी में मिलाएं।

प्रयोग शुरू करने से पहले एनारोबिक मॉनिटर की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एनारोबिक चैंबर में ऑक्सीजन न हो। 96 अच्छी तरह से टेम्पलेट के अनुसार प्लेट लेआउट डिजाइन करें। तीन की तकनीकी प्रतिकृति में प्रयोगों को चलाने के लिए यह 32 विभिन्न उपचारों के लिए अनुमति देगा, जो शीशियों को स्थापित करने के लिए चार बाय आठ ग्रिड के साथ सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है।

परख प्लेट लेआउट के अनुसार चार बाय आठ ग्रिड सेट करें। इसके बाद ट्रे में सात मिलीलीटर पीएफई मानक शीशियां रखें। शीशियों को केवल शीशी के बाहर हेरफेर करके संभाला जाना चाहिए।

प्रत्येक उपचार के अनुरूप प्रत्येक शीशी में एक्सपोजर मध्यम मात्रा जोड़ें। प्रत्येक शीशी के लिए प्लेट लेआउट के अनुसार परीक्षण किए जाने वाले रासायनिक चर की संबंधित मात्रा जोड़ें। अब हर शीशी में नाइट्रेट डालें ताकि एकाग्रता 200 माइक्रोमोलर हो।

संविलियन बायोसेंसर उपचार रिक्त स्थान के लिए इस कदम को बाहर करें। शीशियों में पारे को जोड़ने के लिए सबसे पहले चार से आठ माइक्रोमोलर स्टॉक लें और अच्छी तरह हिलाएं। एक काम पारा समाधान बनाने के लिए 100 से 250 नैनोमोलर की एकाग्रता के लिए एक सात मिलीलीटर PTFE शीशी में समाधान और जोखिम माध्यम पतला।

इस वर्किंग सॉल्यूशन से प्लेट लेआउट के हिसाब से जरूरी शीशियों में मरकरी डालें। पारा या कैडमियम जोड़ने के बाद मैन्युअल रूप से प्लेट को कक्षीय गति में हिलाएं। प्रयोग अब हल में विशिष्ट करने के लिए पारा या कैडमियम के लिए आवश्यक समय के आधार पर रोका जा सकता है ।

जब प्रयोग फिर से शुरू हो जाता है, तो एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे बायोसेंसर स्टॉक को आगे-पीछे करें। फिर प्रत्येक शीशी में बायोसेंसर स्टॉक के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और मैन्युअल रूप से प्लेट को पहले की तरह हिलाएं। ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए थाली पाठक गर्म और हर दो बिंदु पांच से पांच मिनट पढ़ता है के साथ दस घंटे के लिए एक गतिज रन की स्थापना की ।

रीडिंग के बीच में मिलाते हुए एक कक्षीय । 440 नैनोमीटर के फ्लोरेसेंस उत्तेजन और 500 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ फ्लोरेसेंस माप लेने के लिए रन सेट करें। अब 96 अच्छी तरह से प्लेट के इसी कुओं में चार द्वारा आठ ग्रिड में प्रत्येक पीएफई शीशी से 200 माइक्रोलीटर पिपेट करें।

प्रत्येक 200 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने से पहले पांच बार पिपेट। पिपेट टिप को त्यागने के बजाय, पाइपेट की प्रगति का ट्रैक रखने के लिए पीएफई शीशी में पिपेट टिप छोड़ दें। 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर की ट्रे में रखें।

फिर ढक्कन को 96 अच्छी प्लेट पर रखें और परख शुरू करें। यहां प्रतिनिधि परिणाम समय के एक समारोह के रूप में सही फ्लोरेसेंस डेटा दिखा रहे हैं । फ्लोरेसेंस को अकांक्षित बायोसेंसर के लिए पारे की बढ़ती सांद्रता के साथ दिखाया गया है।

सभी मूल्यों को कोई पारा नियंत्रण के लिए खाली हैं । फ्लोरोसेंट चोटियों को पारा या कैडमियम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत दिखाने के लिए निर्धारित किया जा सकता है। प्रेरक और संविलियन दोनों बायोसेंसर के लिए, प्रेरक सेंसर रैखिक रेंज के बीच में पारा या कैडमियम एकाग्रता का उपयोग परीक्षण चर के लिए किया जाना चाहिए।

यहां जिंक के साथ एक अनिर्णादार परिणाम के उदाहरण दिए गए हैं । और बायोसेंसर के लिए पारा जैव उपलब्धता पर मैग्नीशियम और मैंगनीज के साथ एक निर्णायक परिणाम । जिंक के साथ परिणाम बेनतीजा है क्योंकि संविलियन फ्लोरेसेंस विषाक्तता का संकेत देने वाले अकावधान के साथ क्षय होता है।

इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय कैडमियम या पारा की सांद्रता में प्रवेश करना याद रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि इनका उपयोग बायोसेंसर को जांचने के लिए किया जाएगा। इस प्रक्रिया के बाद, जलीय प्रणालियों के थर्मोडायनामिक मॉडलिंग जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जा सकता है जैसे कि पारा या कैडमियम की विशिष्ट रासायनिक प्रजातियां उनकी जैव उपलब्धता को कैसे प्रभावित करती हैं। यह न भूलें कि कैडमियम और पारा और सल्फ्यूरिक एसिड जैसे मजबूत एसिड के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने जैसी सावधानियां हमेशा बरती जानी चाहिए।

इसके विकास के बाद इस तकनीक ने पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए अर्ध वास्तविक समय अवायविक पारा या कैडमियम बायोअवयबिलिटी और आनुवंशिक रूप से पथिक रोगाणुओं का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।