Environment
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Anaerob Biosensor test för påvisande av kvicksilver och kadmium
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att använda en anaerob mikrobiell biosensor hela-cell för att utvärdera hur olika miljövariabler påverka biotillgängligheten av Hg och Cd för bakterier i syrefria miljöer.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor angående den biogeokemiska cyklingen av kadmium och kvicksilver såsom hur olika miljövariabler påverkar deras biotillgänglighet för bakterier. Den största fördelen med denna teknik är att den erbjuder quasi realtid biotillgänglighet data och livskraftiga celler oberoende av förekomsten av syre. Generellt individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom det finns många tid känsliga steg som kräver mycket noggrann uppmärksamhet på detaljer.
Demonstrerar proceduren blir Ben, en grad-elev från mitt labb. För att förbereda för analysen, hämta kvicksilver inducerbara biosensor och den kontitivt uttryckta biosensorn från en minus 80 grader Celsius cryo lager. Platta cellerna på Lysogeny buljong plattor som innehåller 120 mikrogram per milliliter ampicillin.
Odla tallrikskulturerna i en inkubator vid 37 grader Celsius över natten. Mellan 4:30 och 5 p.m. inokulera en kultur i tio milliliter lb med ampicillin och växa över natten vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm.
Vid mellan nio och tio a.m nästa morgon föra kulturen samt den tidigare beredda tillväxtmedium i anaerobkammaren. Tillsätt sedan åtta milliliter av färskt tillväxtmedium och 210 mikrogram per milliliter ampicillin i ett sterilt balchrör.
Samla nu två milliliter av den över natten odlade kulturen och överföra till en två milliliter mikro centrifug röret. Efter centrifugering vid 10, 000 RCF i 90 sekunder, ta bort supernatanten och resuspend i två milliliter färskt tillväxtmedium. Tillsätt sedan den återanvändbara kulturen till balchröret som innehåller åtta milliliter av färskt tillväxtmedium och ampicillin.
Med steril teknik placerar du försiktigt en gummipropp på balchröret innan du tar ut det ur den anaeroba kammaren. Placera sedan röret i en inkubator och växa anaerobt vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm. Mellan tre och fem .m.
föra balch röret med kulturen, en ny steril balch röret, och tillväxtmediet i anaerob kammare. Tillsätt 100 mikroliter av kulturen till 10 milliliter av färskt tillväxtmedium med ampicillin i det sterila balchröret. Med hjälp av steril teknik, placera försiktigt en gummipropp på balchröret.
Ta bort röret från den anaeroba kammaren innan du odlar det över natten vid 37 grader Celsius med skakningar vid 220 rpm. Mellan nio och tio a.m nästa dag, överföra kulturen och tillväxtmediet tillbaka till den anaeroba kammaren.
Återigen lägga åtta milliliter tillväxt medium och ampicillin i en steril balch rör. Överför två milliliter av den över natten fullvuxna kulturen in i ett två milliliter mikrocentrifugrör. Efter centrifugeringen som tidigare, ta bort supernatanten och resuspend cellerna i två milliliter av färskt tillväxtmedium.
Tillsätt sedan den återanvändbara kulturen till balchröret som innehåller det färska tillväxtmediet och ampicillin. Med hjälp av steril teknik, placera försiktigt en gummipropp på balchröret. Ta bort den från kammaren och växa anaerobt vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm.
Övervaka kulturens tillväxt med hjälp av en spektrofotometer genom att virvelsa kulturen och sedan mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer eller OD600. Efter tre till fyra timmars förväntad tillväxt, bör kulturen nå en OD600 av 6. Nu tar röret i anaerob kammaren och överföra kulturen i två två milliliter mikro centrifugrör.
Efter centrifugeringen som tidigare avlägsna supernatanten och resuspend varje cell gom i två milliliter av färskt exponeringsmedium. Upprepa detta tvättsteg en gång för att ta bort eventuella spår av tillväxtmediet. Nu kombinera både mikro centrifugrör av cellodling i en sju milliliter PTFE standard injektionsflaska för att erhålla biosensor beståndet för användning i exponeringsanalysen.
Innan du startar experimentet kontrollera anaerob monitorn för att säkerställa att det inte finns syre i den anaeroba kammaren. Designa plattans layout enligt en 96 brunnsmall. För att köra experiment i tekniska kopior av tre detta kommer att möjliggöra 32 olika behandlingar, som bäst representeras med en fyra av åtta rutnät för att ställa in injektionsflaska.
Ställ in de fyra med åtta rutnät enligt assay plate layout. Placera sedan sju milliliter PTFE standard injektionsflaska i facket. Injektionsflaskan ska endast hanteras genom att manipulera utsidan av injektionsflaskan.
Tillsätt den exponeringsmedie volymen i varje injektionsflaska som motsvarar varje behandling. Till varje injektionsflaska tillsätt motsvarande volym av den kemiska variabeln som ska testas enligt plattans layout. Tillsätt nu nitrat till varje injektionsflaska så att koncentrationen blir 200 mikromolar.
Uteslut detta steg för kontitutiva biosensorbehandlingsstom. För att lägga till kvicksilver i injektionsflaskan, ta först de fyra till åtta mikromolar lager och skaka väl. Späd lösningen och exponeringsmediet i en injektionsflaska med sju milliliter PTFE till en koncentration på 100 till 250 nanomolar för att göra en fungerande kvicksilverlösning.
Från denna arbetslösning, tillsätt kvicksilver till de nödvändiga injektionsflaskan enligt plattan layout. Efter att ha lagt till kvicksilver eller kadmium manuellt skaka plattan i en orbital rörelse. Experimentet kan pausas nu beroende på den tid som krävs för kvicksilver eller kadmium att speciatera i lösning.
När experimentet återupptas, försiktigt pipet biosensor lager fram och tillbaka för att säkerställa homogenitet. Tillsätt sedan 100 mikroliter av biosensorbeståndet till varje injektionsflaska och skaka plattan manuellt som tidigare. Värm upp tallriksläsaren till 37 grader Celsius och sätt upp en kinetisk körning i tio timmar med läsningar varannan punkt fem till fem minuter.
En omloppsbana skakar mellan avläsningar. Ställ in körningen för att ta fluorescensmätningar med en fluorescensutexcitation av 440 nanometer och ett utsläpp av 500 nanometer. Nu pipettera 200 mikroliter från varje PTFE-injektionsflaska i de fyra av åtta ruten i motsvarande brunnar i 96 brunnsplattan.
Pipett fram och tillbaka fem gånger innan du överför varje 200 mikroliter. Istället för att kassera pipettspetsen, låt pipetten i PTFE-injektionsflaskan hålla reda på pipetteringsförlopp. Placera 96 brunnsplattan i tallriksbrickan på tallriksläsaren.
Placera sedan locket på 96 brunnsplattan och börja analysen. Här är representativa resultat som visar korrigerade fluorescensdata som en funktion av tiden. Fluorescens visas med ökande koncentrationer av kvicksilver till den inducerbara biosensorn.
Alla värden är tomma till den ingen kvicksilver kontroll. De fluorescerande topparna kan kvantifieras för att visa den fluorescerande signalen som en funktion av kvicksilver eller kadmiumkoncentration. För både de inducerbara och de kontitutiva biosensorerna bör kvicksilver- eller kadmiumkoncentrationen i mitten av det inducerbara sensorernas linjära område användas för testning av variabler.
Här är exempel på ett resultat som inte är övertygande med zink. Och ett avgörande resultat med magnesium och mangan på kvicksilver biotillgänglighet till biosensorn. Resultatet med zink är resultatvärt eftersom den utgörs av fluorescens sönderfaller med inducerbara fluorescens som indikerar toxicitet.
Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att komma in i koncentrationerna av antingen kadmium eller kvicksilver eftersom dessa kommer att användas för att kalibrera biosensor. Efter detta förfarande, andra metoder som termodynamisk modellering av vattenhaltiga system kan utföras för att svara på ytterligare frågor som hur gör specifika kemiska arter av kvicksilver eller kadmium påverka deras biotillgänglighet. Glöm inte att arbeta med kadmium och kvicksilver och starka syror såsom svavelsyra kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder såsom bärande av personlig skyddsutrustning bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.
Efter dess utveckling denna teknik banade väg för forskare inom området miljömikrobiologi att utforska kvasi realtid anaerob kvicksilver eller kadmium biotillgänglighet och genetiskt tractable mikrober.
Tags
Miljövetenskap fråga 142 Biosensor kvicksilver kadmium anaerob biotillgänglighet metall artbildningRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
