Cancer Research
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Summary November 21st, 2018
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在这里, 我们提出了一个方案, 从白血病患者骨髓中分离白血病细胞, 并分析他们的代谢状态。对原代白血病细胞代谢状况的评估有助于更好地确定原代细胞的需求, 并可导致更个性化的药物。
Transcript
这种方法可以帮助回答有关白血病细胞代谢途径设置的关键问题。该技术的主要优点是，它允许测量原发性白血病细胞在活细胞中的实时代谢。首先以一比一的比例稀释从PBS中从白血病患者获得的骨髓样本。
小心地，将稀释的骨髓样本的六毫升层层，在15毫升锥形管中，在新鲜制备的密度梯度介质中，用六毫升的密度梯度介质分离细胞，通过密度梯度离心分离细胞。使用巴斯德移液器小心地将单核细胞的接口层转移到一个新的 50 毫升锥形管中，该管含有 5 毫升 PBS，用于离心洗涤。然后，将单核细胞颗粒重新在两毫升无菌PBS中重新计算。
稀释细胞到三倍10到七个细胞每毫升浓度。在两个含有20毫升RPMI介质的T75烧瓶中加入1毫升细胞，在37摄氏度和5%CO2下进行16至24小时的孵育。同时，为准备细胞外通量分析板，在两个、八个孔的细胞外通量分析仪板的每个孔中加入12.5微升的细胞粘合剂溶液。
20分钟后，吸气细胞粘合剂，每次洗涤用200微升无菌水洗两次每井。第二次洗涤后，将板留在机罩中，直到水井干燥。将传感器墨盒倒置在实验室工作台上。
分离流量分析仪的公用板和传感器盒。并在公用板的每个孔中用200微升的卡兰特填充，并在井外侧用400微升的卡兰特填充每条护城河。将传感器盒返回到现在包含校准器的公用板，将墨盒组件放在加湿的 37 摄氏度培养箱中，过夜时不带 CO2。
然后打开细胞外通量分析仪，让它在一夜之间加热到37摄氏度。第二天早上，将细胞从烧瓶转移到50毫升锥形管进行离心。将颗粒重新用一毫升适当的实验介质重新暂停，用于计数。
将细胞以四倍十0重新作用，以四倍十次将六个细胞重新用于实验中浓度的四微升。并在通量分析仪板的B至B孔中加入50微升细胞。并将180微升的实验介质打入井中，以H、H为背景控制井。
离心缓慢并小心地将130微升的实验介质添加到B型井B-G.，并在显微镜下直观地确认细胞稳定地粘附在每口井的底部。然后将通量分析板返回加湿的 37 摄氏度培养箱，无 CO2 30 分钟。在孵化结束前 20 分钟，根据表中所示的实验协议，将化合物加载到墨盒的适当喷油器端口中。
然后建立相应的细胞外通量分析程序。启动程序，并在提示时将校准板替换为检测板。在糖解压力测试中，只使用基础介质，使细胞缺乏营养。
获得的第一个参数是基础酸化，它应反映细胞中储存的葡萄糖量。第一次注射后，细胞外酸化率增加，因为细胞利用葡萄糖，可以发酵葡萄糖到乳酸。第二次注射中的寡霉素A抑制ATP合成酶，从而引导细胞主要通过糖解产生ATP，从而导致细胞外酸化率的进一步升高。
而注射2-脱氧-D-葡萄糖完全抑制糖解和细胞外酸化率下降。在细胞米托压力测试中，使用谷氨酰胺和葡萄糖补充的培养基，使细胞不会被剥夺所有营养。基础呼吸参数反映其基础代谢状态。
第一次注射寡霉素 A 后，细胞抑制线粒体呼吸，并切换到糖解，这表示氧气消耗率的下降。然而，第二次和第三次注射FCCP，将ATP生产与呼吸耦合，使细胞现在以最大速率消耗氧气。氧气消耗率上升到最高值。
最后一次注射罗酮和抗霉素混合物完全抑制线粒体呼吸，将耗氧率降至几乎为零。在尝试此程序时，必须评估样本中爆炸的百分比，以确保仅测量白血病细胞的代谢参数。在实现此方法时，必须仔细优化栽培条件和数据规范化。
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