Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için
Chapters
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.
Transcript
Bu yöntem, hem yüksek iş artışı hem de yüksek hassasiyette hücre dışı proteinler için yeni bağlayıcı ortakların saptanmasını sağlayarak protein etkileşimleri alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, protein sadece birkaç mikrogram ile, mikro dizi yazıcı kullanarak slaytlar yüzlerce oluşturabilirsiniz. Slayt yazdırma için standart bir mikro arrayer kullanın.
Bu cihaz, çalışma başına 57 slayt kapasitesine sahiptir, 48 tespit pimi tutan bir yazdırma kafası kullanır ve slayt başına 8.000 noktaya kadar sığdırılabilir. Stok plakalarından kuyu başına 10 mikrolitre numunede 384 kuyu plakası kullanarak çalışma plakaları oluşturun. Mikro arrayer kullanarak slayt yazdırma dan önce bu adımı el ile gerçekleştirin.
Daha sonra protein lekelerinin susuzluklarını önlemek için %60 nemde epoksi silane slaytlara quill tipi tespit pimleri ile proteinleri noktalayın. Cy3 etiketli sığır serum albumin maske uydurma için dizi görselleştirmek için her protein örneği arasında yinelenen tespit edilebilir. Yazdırmanın ardından, protein mikro dizi slaytlarını nemli ortamdan çıkarın.
Daha sonra, slayt yüzeyine yerleşir engelleme çözümü ince bir sis oluşturmak için bir ultrasonik fogger kullanın. Daha sonra, yüzeyi etkinleştirmek için PBST%5 süt ile slaytları bir gecede engelleyin. Donmayı önlemek için slaytları %50 gliserolda eksi 20 derecede saklayın.
Hücre dışı proteinler arasındaki etkileşimler genellikle düşük yakınlıkları ile karakterizedir. Bu etkileşimlerin saptanmasını sağlamak için, bağlayıcı aviditeyi artırarak, FC olarak ifade edilen sorgulanmış proteinin yakalanmasına dayalı çok yaygın bir yaklaşım geliştirdik. Metin protokolünde açıklandığı gibi Cy5 mono reaktif boya ile etiketlenmiş olan taşıyıcı IgG'yi döndürün.
Sorgu proteini ve Cy5 IgG'nin molar oranını hesaplamak için, sorgu proteininin moleküler ağırlığını IgG'nin moleküler ağırlığına bölün ve gerekli Cy5 IgG konsantrasyonunu belirlemek için mililitre başına 40 mikrogram ile çarpın. Tüm oranlar belirlendikten sonra FC etiketli sorgu ve Cy5 IgG proteini A mikro boncukları birleştirerek mikro boncuk protein kompleksini oluşturur. PBS'deki süspansiyonu oda sıcaklığında ışıktan korunan bir tüp rotatöründe 30 dakika karıştırın.
Gösterime başlamak için, hibridizasyon istasyonuna yüklemeden önce hazırlanan slaytları oda sıcaklığında ısıtın. Tarama gerçekleştirmek için, ilk kalıntı gliserol kaldırmak için bir dakika pbst ile mikro dizi yıkayın. PBS%5 süt ve inkübat başına mililitre protein Başına 200 mikrolitre Yük PBS%5 süt ve inkübat 30 dakika boyunca karmaşık olmayan protein bir mikro boncuk FC etiketli proteinler için bağlanmasını önlemek için mikro dizi mevcut olabilir.
Hibridizasyon istasyonu PBST ile slaytlar yıkadı sonra, yük 200 mikrolitre sorgu mikro boncuk kompleksi, mililitre protein A başına bir miligram varlığında ve kuluçka 30 dakika. Hibritleştirme ve hibridizasyon istasyonu tarafından slaytların yıkanması sonrasında, su ile slaytlar durulayın ve bireysel 50 mililitrekonik tüpler yerleştirin. Tüpleri 900 kez G'de beş dakika boyunca döndürerek kurulayın.
Son olarak, cy3 ve Cy5 floresansını sırasıyla 532 ve 635 nanometrede heyecan verici bir şekilde algılamak için uygun bir mikro dizi tarayıcısı ile slaytları tarayın. Burada gösterilen yazdırılmış bir slayt temsili bir görüntüdür. Cy3 etiketli büyükbaş hayvan serum albümin lekeleri yeşil.
Noktalar, yazdırma işleminin kalite kontrolü olarak çoğaltılarak yazdırıldı. Hücre dışı protein mikro dizi teknolojisini kullanarak bağlayıcı ortakların tanımlanması için taranmış yetim proteininin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Yinelenen kırmızı noktalar, ekranlı sorgu proteini için bir isabet olarak tanımlanır.
Açıklanan bu yöntem son derece çok yönlüdür ve protein kütüphaneleri bir gam baskı için kullanılabilir, onlar özel protein aileleri veya bizim ki gibi proteinlerin büyük derlemeler olabilir. İlgilenen herhangi bir protein değerlendirilebilir. Bu prosedürü denerken slaytları dikkatli bir şekilde işlemek ve basılan proteinlerin aktivite kaybını önlemek için kurumamasını sağlamak önemlidir.
İlgi çekici bir proteinin ekranını takip ederek, yüzey plazmon rezonansı gibi ortogonal teknolojiler kullanılarak gözlenen darbeleri daha da doğrulamak için son derece tavsiye edilir. Bu teknik, gelişiminden sonra araştırmacıların insanlardaki hücre dışı protein etkileşimlerini incelemelerinin önünü açmıştır.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
