Summary
Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.
Abstract
Salgılanan faktörler, membran hayvan zinciri reseptörleri ve etkileşen eşleri hücresel iletişim ana düzenleyiciler ve inisiyasyon cascades homeostazı ve hastalık sırasında sinyal ve bu nedenle ana tedavi hedefleri temsil. Kendi alaka rağmen bu etkileşim ağları önemli ölçüde geçerli veritabanlarında underrepresented kalır; Bu nedenle, en hücre dışı proteinler belgelenmiş bağlama ortak var. Öncelikle fonksiyonel proteinler ve zayıf, düşük benzeşme kez hücre yüzey reseptörlerinin arasında kurulan protein etkileşimleri ifadesi de dahil olmak üzere hücre dışı proteinler incelenmesi ile ilgili sorunlar nedeniyle bu tutarsızlık olduğunu. Bu yöntemin amacı bir kütüphane Mikroarray kartvizitlere protein-protein etkileşimleri ile taranması için hücre dışı proteinlerin baskısı tarif etmektir. Zayıf etkileşimlerin algılamasını etkinleştirmek için multimerization sorgu protein altında eğitim dayalı bir yöntemi açıklanmıştır. Artan multivalency için bu multimerization microbead tabanlı yaklaşımın birleştiğinde, protein mikroarray geçici protein-protein etkileşimlerinin sağlam algılama içinde yüksek üretilen iş sağlar. Bu yöntem bir hızlı ve düşük örnek tüketen-yaklaşım yeni etkileşimler ilgili ekstraselüler herhangi bir protein tanımlanması için sunuyor. Protein mikroarray baskı ve protokol filtreleme açıklanmıştır. Bu teknoloji araştırmacılar protein etkileşimleri ekstrasellüler alanda keşfi için sağlam bir yöntem arayışı için faydalı olacaktır.
Introduction
Burada gözden yöntemi Mikroarray biçiminde, bu kütüphane karşı ilgi bir hedef ile taranması için bir yöntem ve ardından hücre dışı proteinler topluluğu yazdırma işlemi açıklar. Biz düşük bağlama benzeşim tarafından karakterize etkileşimleri algılanması için çok önemli bir adım olarak protein multimerization belirledik. Bu etkileşimlerin algılama geliştirmek için üzerinde ilgi lastikteki kullanarak sorgu proteinin multimerization dayalı bir iletişim kuralı açıklar.
Salgılanan ve hücresel iletişim, sinyal ve microenvironment ile etkileşim anahtar düzenleyiciler (toplu olarak adlandırdığı hücre dışı proteinler) hücre yüzey-proteinlerin etkileşen eşleri ile birlikte vardır. Onlar, bu nedenle, birçok fizyolojik ve patolojik süreçlerinin düzenlenmesinde gereklidir. İnsan genomu (≈5, 000 proteinler) yaklaşık dörtte hücre dışı proteinler için kodlar, onların önemi ve erişilebilirlik için sistematik olarak teslim edilen uyuşturucu göz önüne alındığında, ilaç geliştirme1için anahtar hedefler temsil eder. Sonuç olarak, hücre dışı proteinler bilinen farmakolojik eylem "druggable" proteomu olarak piyasada onaylı ilaçlar için protein hedeflerle % 70'den fazla temsil eder. Onların önemi ve bereket rağmen ekstraselüler protein-protein etkileşim (ePPI) ağları kullanılabilir veritabanları son derece underrepresented kalır. Bu temelde hangi en çok kullanılan teknolojileri2kullanarak onların karakterizasyonu engellemektedir karmaşık biyokimyasal yapısı hücre dışı proteinler nedeniyle var. İlk olarak, zar proteinleri, sık sık sert çamaşır koşulları ve deterjanlar içerir bir işlem solubilize zordur; İkinci olarak, ne zaman bu proteinler yaygın olarak ifade edilir yok olan glikozilasyon Contegra sistemleri kullanılan gibi hücre dışı proteinler genellikle ilgili translasyonel modifikasyonlar eksikliği. Son olarak, Co reseptörleri bağışıklık hücreleri üzerinde ifade gibi reseptörleri arasındaki etkileşimler çoğu kez geçici ve çok düşük benzeşim karakterize (KD ~ 1 mikron > 100 mikron aralığı). Tamamen, bu proteinler ve ortakları en çok render kendi bağlama benzeşme arıtma/kütle spektrometresi (AP/MS) veya Maya-iki-hibrid, ekstrasellüler alanda etkileşimleri algılanması için uygun olmayan gibi teknolojileri kullanılmaktadır 2 , 3.
Bu teknik zorlukların üstesinden ve hücre dışı proteinler için roman etkileşimler bulma hızlandırmak için bir çaba olarak, bir yüksek kapsama ekstraselüler protein mikroarray4,5geliştirdik. Microarrays yüksek yoğunluklu yüzeyler örnek küçük miktarda üreten avantajı sunuyor ve genellikle yüksek üretilen iş çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Protein mikroarray tabanlı çalışmalar daha önce de olsa esas olarak sitozolik etkileşimleri veya belirli protein aileler6,7odaklanarak ilgili birkaç model organizmalar için protein etkileşimler anlayışlar sağlamış, 8. Buna ek olarak, sınırlı iş bu teknolojiyi kullanarak hücre dışı protein etkileşimleri araştırmak için yapılmıştır. EPPIs çalışmaların arıtılmış salgılanan proteinler kapsamlı ve çok çeşitli Kütüphane binası tarafından etkinleştirmek için bir protein mikroarray yöntemi geliştirdik ve tek transmembran (STM) reseptörleri için erimiş olarak rekombinant ekstrasellüler etki alanları (ECD) dile getirdi. yaygın Etiketler benzeşme arıtma4için. Protein mikroarray ekranlar başarısı ağır bir yüksek kaliteli protein Kütüphane kurulması dayanmaktadır. Kütüphane ve sorgu protein ifadesi için memeli hücreleri veya böcek hücreleri tercihen Contegra ifade sistemleri olarak translasyonel modifikasyonlar glikozilasyon veya disülfür bağları gibi uygun ek sağlamak için seçilmiştir. SDS-sayfa, boyutu dışlama Kromatografi ve çok açılı lazer ışık saçılma Rekombinant protein kalitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tekniklerdir. Protein Kütüphane sonra epoxysilane slaytlar tespit ve uzun vadeli kullanım için-20 ° C'de depolanan. Yukarıda protein konsantrasyonları 0.4 mg/mL aşağıda belirtilen iletişim kuralı için tavsiye edilir. Bu nedenle, düşük ifade protein konsantrasyonu adım önce örnek baskı ve depolama gerektirebilir. Yine de, bu teknik büyük bir avantajı gerekli protein küçük birimdir (protein 50 μg gerçekleştirmek için yeterli > 2000 ekranları), en az sorgu protein tüketiminin (yineleme ekran başına 20-25 μg) yanında. İletişim kuralı ve ekipmanlar kullanarak burada açıklanan ve kitaplıklar mevcut olması şartıyla, bireysel sorgu proteinler için sonuçlar bir iş günü içinde oluşturulabilir.
Kimlik tarafından en sık kullanılan metodolojiler engellemektedir onların karakteristik zayıf veya geçici doğa içinde protein etkileşimleri ekstraselüler ortamda hafiye büyük bir meydan okuma kaynaklanmaktadır. Bağlama hırs büyük ölçüde artan duyarlılık zayıf protein etkileşimleri9,10,11algılanması için geliştirir. Multimerize bir yönteme geliştirdiğimiz bu ilke (Fc füzyon olarak) sorgu proteinlerin temel protein A kaplı boncuk4,5kullanarak. Biz bunun yerine bir alakasız insan immünoglobulin G Cy5 ile etiket ve böylece herhangi bir eserler doğrudan fiil nedeniyle ortadan kaldırarak protein A boncuk için sorgu protein ile birlikte ekleyin rasgele etiketleme tarafından herhangi bir potansiyel inactivation sorgu protein önlemek için bir faiz protein boya. Birkaç ortak reseptör çiftleri micromolar benzeşim göz önüne alındığında, multivalent kompleksleri büyük sinyal gürültü oranı, çözünür proteinler4ekranlı Fc-füzyon sorgu proteinler karşılaştırıldığında geliştirmek.
Özet olarak, bu iletişim kuralının amacı reseptör-ligand etkileşimlerin tanımlanması için önceden varolan bir hücre dışı protein kitaplığı içeren Mikroarray slaytların hazırlanması tarif etmektir. Yazdırma, tarama bir proteinin hücre dışı protein Kütüphane karşı ilgi için bir iletişim kuralı ve ardından slayt için adımları gözden geçirin. Ayrıca, gelişmiş lastikteki artan hırs altında eğitim protein elde etmek için temel ePPIs tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan ekstraselüler protein mikroarray teknoloji tarama ve Roman ePPI düşük yanlış pozitif oranları ile ve algılama tek mikrogram miktarların altında sorgu proteinin kullanan tarafından için hızlı, sağlam ve etkili bir yaklaşım temsil eder. soruşturma. Bu teknoloji reseptörleri12,13viral immunoregulators14dahil olmak üzere, çeşitli için ilgili yorumlara önceden bilinmeyen hücresel işlevler ve sinyal yollar sağlayan birden fazla çalışmalar yakıt, ve hücre dışı herhangi bir protein ilgi de-orphanize için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre dışı insan proteinler Kütüphanesi nesil
- Hücre yüzey reseptörlerinin veya protein mikroarray kütüphane oluşturmak ilgi salgılanan proteinler listesini derleyin. Belirli protein aileler (örneğin, immünglobulin süper) ya da proteinler seçmeli olarak özellikle türleri çalışma için seçili hücrenin dile getirdi.
- Hücre için yüzey reseptörlerinin, sinyal peptid ve yazılım araçları kullanarak transmembran bölge tespit ederek ekstrasellüler etki alanı (ECD) sınırları belirlemek. Bazıları ilgili araçları, çevrimiçi serbestçe kullanılabilir, Malzemeler tablo15,16,17,18içinde başvurulan.
- ECD faiz ve klon genler için ilgili vektör sentez. Salgılanan proteinler veya ortak benzeşme Etiketler bir sayıya erimiş STM ECD reseptörleri ile uygun vektör transfected hücre şartına medyadan veya baculovirus-böcek hücre ifade sistemleri saf.
Not: Memeli hücre-esaslı sistem (HEK/293 veya CHO hücreleri gibi) uygun protein katlanması olasılığı ve glikozilasyon gibi ilgili ardından değişiklikleri eklenmesi en üst düzeye çıkarmak için tavsiye edilir. - Proteinler standart benzeşme arıtma yöntemleri tarafından arındırmak. Önceki çabaları otomatik veya yarı otomatik yordamlar yüzlerce proteinlerin faiz9,19,20oluşturmak için ölçeklendirilebilir proteinlerin saflaştırılması için uygun tarif var, 21.
Not: SDS-sayfa, boyutu dışlama Kromatografi (S) veya çok açılı lazer ışık saçılma (alışveriş merkezleri) are salık vermek kovalent olmayan herhangi bir toplama değerlendirmek için ve protein hazırlıkları için genel kalitesini kontrol etmek için. - Proteinler 200 veya 400 μg/ml mümkün olduğunca ayarlamak ve seyreltik-20 ° C'de kriyojenik şişeleri uzun süreli depolama için % 80 gliserol ile stokları Bunlar ana hisse senetleri temsil eder ve yalnızca gerekli olduğunda erişilmelidir.
- Aliquots her protein (100 μL) 96-iyi tabaklar (hisse senedi tabaklar) aktarın, yapışkanlı folyo ile kapatın ve Mikroarray slayt hazırlama kadar-20 ° C'de depolayın. Hisse senedi plakaları donma-çözülme döngüsü en aza indirmek ve protein istikrarı sağlamak için oluşturulur.
2. hücre dışı Protein Mikroarray yazdırma
- Standart bir microarrayer slayt yazdırmak için kullanın. Burada açıklanan protokol için kullanılan alet 57 slaytlar/çalışma kapasitesi ve 48 tespit pimleri tutan bir yazdırma kafasını kullanır. Bu pin ~ 100 mikron çapında ~ 350 mikron bir nokta nokta mesafe tarafından ayrılmış noktalar oluştur ve yük başına 0,25 μL çizer. Bu yapılandırma altında slayt başına 8.000 noktalar kadar çıkılabilir.
- Çalışma plakaları (384 iyi plaka, 10 μL örnek/iyi) hisse senedi plakalar oluşturur. El ile microarrayer kullanarak slayt yazdırmadan önce bu adımı gerçekleştirin. O zaman, proteinler (protein noktalar susuzluktan önlemek için) % 60 nem, epoxysilane slayta quill tipi tespit pimleri ile spot.
Not: Cy3 etiketli Sığır serum albumin (BSA) protein örnekleri (5 μg/mL PBS/40% gliserol) arasındaki çoğaltmaları içinde maskesi (bkz: 4) montaj için dizi görselleştirmek için lekeli olabilir. Tavsiye rağmen bu isteğe bağlı bir adımdır. - Sonraki baskı, protein mikroarray slaytlar oksijen ortamdan kaldırabilirsiniz ve bunları bir gecede PBST yüzey devre dışı bırakabilirsiniz sütte % 5 ile engellemek.
Not: Ultrasonik bir sisleme slayt yüzeye yerleşir çözüm engelleme ince bir sis oluşturmak için kullanmak için tercih edilen bir yaklaşımdır. - Slaytları-20 ° C'de % 50 gliserol içinde donma önlemek için depolama.
3. Multivalent yem konut projeleri hazırlanması
Not: Hücre dışı proteinler arasındaki etkileşimler kez düşük benzeşim tarafından karakterize edilmektedir. Bağlama hırs, bir multivalent yaklaşımı Fc öğesini ECD ifade sorgu protein yakalama dayalı artırarak bu etkileşimlerin algılamasını etkinleştirmek için Gelişmiş4protein A kaplı lastikteki oldu.
- Taşıyıcı Algılama Cy5 monoreactive boya için kullanılan IgG etiket ve desalting sütunları kullanarak ücretsiz boya ayrı. Boya protein oranları için ultraviyole 280 ve 650 nm absorbans ölçerek belirlemek.
Not: Normal Protein-boya oranları 2.0 ve 4.0 arasında kullanılır. Bu Cy5 conjugates 100.000 x g etiketleme işlemi nedeniyle olası çözünür toplamları kaldırmak 15 dakika de spin için tavsiye edilir. - Protein A karşı sorgu protein sabit bir miktarda titrasyon tarafından en iyi microbead protein oranı belirler. Nerede ücretsiz hiç Fc öğesini protein kalır, boncuk asgari doyurarak miktar olarak rekabetçi bir tahlil biolayer Interferometry tarafından belirlenen kullanarak ölçülen tarama için kullanılır.
- Microbead-protein kompleksleri Fc öğesini sorgu ve Cy5 IgG protein A lastikteki ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika içinde PBS bir tüp rotator mix ile kuluçka formu.
- Bu komplekslerin oluşturmak için 20 μg/mL nihai bir konsantrasyon sorgu protein kullanın. Sorgu protein ve Cy5-IgG molar oranını hesaplamak için sorgu protein molekül ağırlığı IgG moleküler ağırlık bölmek (150.000 Da) ve 40 μg/Cy5-IgG gerekli konsantrasyonu belirlemek için mL tarafından çarpın.
- Ek örnekler çözünür protein slaytlar üzerinde dizi bulunabilir Fc füzyon protein bağlayıcı herhangi bir ücretsiz protein A boncuk engellemek için bir (1 mg/mL) hemen önce kuluçka Mikroarray ile (4.2 bölümüne bakın).
Not: Son tepki birim kullanıldığında hibridizasyon istasyonu veya kuluçka odası bağlı olarak değişebilir. Malzemeler tablo açıklanan araçları örnek kuluçka nispeten küçük birimler (slayt başına ~ 200 μL) kullanarak sağlar.
4. hücre dışı Protein Mikroarray tarama ve işleme.
Not: Otomatik işlem platformları sağlamak üreticileri bir dizi vardır. Hibridizasyon İstasyonu yoksa, aşağıdaki adımları el ile yapılabilir, slaytları tutmak için arabellek yeterli hacmi olduğunu kontrol ettikten ve her zaman sular altında.
- Slaytlar, oda sıcaklığında sıcak ve hibridizasyon İstasyonu üzerine yüklemeden önce kalan gliserol kaldırmak için PBS/0.1% ara 20 (PBST) ile durulayın.
- Aşağıdaki tarama protokolü kullanın:
- PBST ile 1 dakika yıkayın.
- 1 mg/mL protein A PBS/5% süt 200 μL yük ve uncomplexed protein önlemek 30 dk içinde Mikroarray mevcut olabilir Fc öğesini proteinler için bağlama bir lastikteki kuluçkaya.
- Beş kez PBST ile 1 dakika yıkayın.
- 1 mg/mL protein A huzurunda karmaşık sorgu: lastikteki 200 μL yük ve 30 dk için kuluçkaya.
- PBST ile 1 dakika yıkayın.
- Hibridizasyon sonra slaytlar su ile durulayın, bireysel 50 mL konik tüplerde yerleştirin ve 5 min için 900 x g de iplik tarafından kuru.
- Son olarak, bir Mikroarray tarayıcı (BSA-Cy3 yazdırılmış Eğer) Cy3 tespit etmek uygun ve Cy5 floresan slaytlarla 532 ve 635 nm, sırasıyla heyecan verici tarafından tarama.
- Eşlik eden Mikroarray veri analizi kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin. (.Gal dosyası) olarak ilgili dizi listesi veri ayıklama yazılımı yüklenir. Bu aşamada, blok bulmak ve özellikleri gerektiğinde el ile hizalama tarafından takip yazılımı, otomatik sığdırma seçeneklerini kullanmak için Cy3-BSA noktalar kullanmaktadır. Daha fazla çözümleme için .gpr dosyaları olarak kaydedin.
5. veri analizi
- GPR dosya ve Mikroarray veri4,5analiz için yaygın olarak kullanılan limma paketi kullanarak R sürecinde verilerini kaydetme.
- Ön işleme için düzeltme ve slayt içinde normalleştirme arka plan yapmak. Bu yana her protein yinelenen noktalar yazdırılır, protein için tek bir puan kütüphanede oluşturmak için her iki çoğaltma ölçümleri birleştirin.
- Her slayt için bir puan hesaplamak ve sonuçları elde etmek için yüksek puanlı aday slaytlar arasına kesişim çözümleyebilirsiniz.
- Yinelenen ayrı baskı-ishal denetlemek için microarrays için slayt değişkenlik ve kavşak araziler verileri her iki ekranları temsil eden son sayısı aramak için kullanın.
- Son olarak, ek bir düzeyi dizi içinde karışık proteinler dışlamak için filtreleme gerçekleştirmek. Bağımsız ekranlar arasında Kullanıcı tarafından tanımlanan belirli bir eşiği aşan proteinler frekans vurmak gibi böyle belirsiz bağlayıcı tanımlanır.
Not: Bu protokol Tom et al. 20135ayrıntılarıyla açıklanmıştır. Bizim durumumuzda arama non-spesifik Ciltçi toplu belirlenmesi dayanmaktadır isabet oranı av ve % 5'lik bir eleme verilere eşik kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre dışı protein mikroarray teknolojisi için iş akışının bir şematik resim 1' de gösterilen. Hücre dışı protein kitaplığı içeren Mikroarray slaytlar kullanılabilir olduğunda, faiz ve veri analizi protein testi ile taranması 1 gün içinde tamamlanabilir. Membran gömülü reseptörleri arasındaki birçok fizyolojik ilgili etkileşimler çok zayıf bağlama güçlü (KD micromolar aralığında) ile karakterizedir. Bu tür etkileşimler tespiti geliştirmek için sorgu (Fc füzyon olarak ifade edilir) protein multimerization protein A-lastikteki üzerinde temel alan bir yöntem geliştirildi. Bu iletişim kuralı metinde anlatılan ve performans ppi gelişmiş algılama için bu yaklaşımın temsili örneği Şekil 2' de gösterilmiştir.
Bir protein mikroarray ekranın temsilcisi bir örnek Şekil 3' te gösterilmiştir. Gösterilen örnekte, bir yetim insan adenovirus immunomodulatory protein etkileşimleri 1.500'den fazla reseptör ECD oluşan bir kütüphane karşı ekranlı veya salgılanan proteinler14. Açıklandığı gibi viral protein ECD recombinantly bir Fc füzyon protein ifade edilen ve sonra multivalent konut projeleri oluşturmak üzere protein A kaplı lastikteki ile inkübe. Protein kompleksleri manuel işlemleri en aza indirmek için hibridizasyon istasyonunu kullanarak gösterildi, ancak, benzer ekranlar hibridizasyon odası veya benzeri cihazlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yinelenen ekranlar için herhangi bir değişkenlik çalıştırmak yazdırma sırasında kontrol edebilmek için ayrı tespit ishal içinde basılmış slaytlar kullanarak çalıştırmak için tavsiye edilir. Şekil--dan yinelenen, bağımsız perde sonuç kavşak araziler gösterir. Olumlu etkileşimler ve genel slayt arka plan kolayca plakaları vurmak arama kolaylaştırmak (Cy5 floresan), tarama üzerine görüntülenir. Not her reseptör isabet güven artırmak için çoğaltmaları kitaplığında nokta için önerilir. Çoğu sorgu proteinler için hiçbiri, özgüllük PPIs tespiti için yöntem gösteren bir veya birkaç sayısı gözlenir.
Belirli sorgu proteinler yüksek arka plan bağlayıcı protein dizi içinde olağan dışı derecede fazla sayıda ve/veya slayt tarafından algılanan gibi göstermek. Deneyim, böyle belirsiz arka plan yalnızca az sayıda proteinler için görülmektedir. Protein doğası ile ilgili faktörler farklı tanıma glikozilasyon motifler gibi spesifik olmayan etkileşimleri etkileyebilir. Şekil 3 özel sayısı tanımlaması iyileştirmelerden viral bir protein yüksek arka plan, gösterdi Mikroarray Kütüphane karşı ekranlı bir örneği gösterilir. İletişim kuralı küçük değişiklikler bu durumlarda (örneğin, artan tuz veya deterjan konsantrasyon), arka plan azaltmak için kabul edilebilir iken deorphanization protein altında eğitim için alternatif yöntemler keşfetmek için önerilir.
Şekil 1: hücre dışı protein microarrays reseptör-ligand etkileşimleri hızlı ve sağlam tanımlanması için. (Adım 1) Bir kütüphane ilgi ekstraselüler proteinlerin derlendi. (Adım 2) Saf protein mikroarray yazıcı kullanarak epoxysilane slaytlar üzerine basılmış ve -20 ° C'de depolanan (Adım 3) Multimerized lastikteki artan hırs ve geçici protein-protein etkileşimleri tespiti için üzerinde ilgi sorgu proteindir. Bir floresan IgG etkisiz etiketli taşıyıcı olarak sorgu: lastikteki ile complexed. (Adım 4) Bir sorgu protein bağlayıcı ortakları için eleme. Otomatik slayt işleme için hibridizasyon İstasyonu kullanarak hücre dışı protein mikroarray karşı Floresan sorgu protein kompleksi tarandı. (5. adım) Slaytlar sonra Mikroarray tarayıcı kullanarak görüntülenir. BSA-Cy3 noktalar 535 nm kanalda görülebilir ve ekrandan vermiştir sayısı vasıl 635 yinelenen yer olarak gözlenen nm. Veri Analizi hit aradığınız için iki bağımsız deney ve kavşak araziler oluşturularak gerçekleştirilir. Sayısı Protokolü bölümünde açıklandığı gibi temel alınarak karşılıklı olarak yüksek puanlar arka plan, yukarıda adı verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sorgu protein için multivalent kompleksleri oluşumu aracılığıyla gelişmiş sinyal. (A) Multimerization. sorgu proteinlerin Sorgu proteinler rekombinant Fc füzyon ifade edilen ve protein A lastikteki formu multimerized kompleksleri için birleştiğinde. (B) yüksek-hırs düşük benzeşme etkileşimleri tespiti için yol açar. Zayıf etkileşimler daha yüksek sinyal noise oranları ve gelişmiş vurmak arama için önde gelen protein mikroarray üzerinde istikrar multimerized sorgu protein sonuçlarında tarafından tanınan hırs. Araziler görselleştirme hitlerinden etkinleştirmeyi CD200, bir microbead karmaşık, ekranlı veya doğrudan Cy5 boya ile etiketli bir çözünür protein için tarama sonuçları gösterir. Multimerization (kırmızı çubuklar) çözünür bir ürün (mavi çubuklar) olarak ekranlı aynı protein ile karşılaştırıldığında önemli sinyal/noise oranı ile düşük benzeşme bağlama ortak CD200R1, protein mikroarray Kitaplığı'nda güçlü algılama sağlar. Gri çubuklar non-spesifik bağlayıcı gösterir. Sadece en iyi 10 etkileşimleri mezarlığına temsil etmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Protein Mikroarray teknoloji kimliği roman reseptör-reseptör virüs-ana etkileşimler için. (A) örnek reseptör keşif sonuçları bir yetim adenoviral immunomodulatory protein için. Görüntüleri gerçek Mikroarray taramaları, çoğaltmaları (kırmızı) benekli proteinler şarkıları gösterilen temsil eder. Deneyleri çoğaltmaları için herhangi bir slayt değişkenliği ve kavşak araziler temsil edilen sonuçları denetlemek için gerçekleştirilir. Siyah noktalar kesişen sayısı her iki bağımsız ishal--dan temsil ise araziler, kırmızı ve mavi noktalar yalnızca bir dizi REPLICATE denilen sayısı temsil eder. Tüm Mikroarray Kütüphane proteinler koleksiyonu ve yeterli ayrılık dizisinin benekli her bireysel protein sağlamak için mevcut sayısı göz önüne alındığında kullanım kolaylığı için iki slayt yazdırılır. (B) arama engellemektedir yüksek arka plan sergilenmesi Viral protein ekran vurmak. Belirli sorgu proteinler yüksek arka plan, birden fazla protein ve/veya slaytları, bu nedenle yüksek Puanlama sayısı tanımlaması için sorunlar poz bağlama yaparak tespit olarak görüntüleyebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetim reseptörleri önemli sayıda insan genom kalır ve Roman etkileşen ortakları daha önce karakterize ligandlar ile hücre dışı proteinler için ortaya çıkmaya devam edin. İnsan etkileşimlerde reseptör-ligand ve model organizmalar tanımlama hücresel iletişim homeostazı yanı sıra hastalığı için önde gelen bozukluk sırasında dikte mekanizmaları anlamak ve bu nedenle yeni veya geliştirilmiş bilgilendirmek için önemlidir tedavi olanakları. Yine de, hücre dışı protein etkileşimler tarafından yaygın olarak kullanılan teknolojiler tespiti özellikle hücresel reseptörleri ve etkileşen eşleri Biyokimya ilişkili teknik sorunlar nedeniyle önemli bir engel temsil etmiştir. Bu raporda biz bir hücre dışı protein mikroarray sorgu proteinler ilgi microbead kompleksleri PPIs gelişmiş algılama için kullanımı üzerinde durularak testi ile taranması için nasıl kullanılacağını açıklar.
Reseptör-reseptör etkileşimleri problama özellikle zor olduğu birçok fizyolojik ilgili çift çok zayıf etkileşim benzeşim micromolar aralığı2,3' te binding ile karakterizedir. Hırs geliştirme multimerization aracılığıyla düşük benzeşme PPIs tespiti için duyarlılık artırmak için yararlı bir strateji olduğu ispatlanmıştır. Fc füzyon proteinler, verimli multivalent microbead-protein sorgu kompleksleri4oluşumu için temel bir yöntem geliştirdik. Multimerization sorgu protein düşük benzeşme PPIs tespit için önemli bir adımdır. Şekil 2' deki örnekte gösterildiği gibi bu yöntem sinyal minimal arka plan koruyarak bir çözünür (non-complexed) analit ekranlı aynı sorgu protein ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artırır. Alternatif olarak, protein mikroarray ekranlar çözünür Cy5 etiketli sorgu protein, bu herhangi bir füzyon etiketi ile uyumludur ve bu gibi bu arasında daha istikrarlı, daha yüksek afinite etkileşimleri tanımlanması için yeterli bir yaklaşım ile yapılabilir çözünür bazı ligandlar ve onların reseptörleri. Bu hırs multimerization lastikteki üzerinde sorgu aracılığıyla arttı çünkü Mikroarray sinyal etkileşim gücü nicel bir ölçüsü değildir unutulmamalıdır. Daha doğrusu, değerlendirme altında proteinlerin monomeric sürümlerle benzeşim bağlama hesaplanmalıdır. Buna ek olarak, herhangi bir isabet Mikroarray teknoloji tespit bağımsız yöntemlerle doğrulanır son derece tavsiye edilir. Biz düzenli olarak yüzey plasmon rezonans bir altın standart biyofiziksel yöntemi PPI çalışmalar ve bağlama kinetik ölçümü için kullanın.
Her ne kadar bu rapor kapsamı dışında bu ağır Mikroarray teknolojisini kullanarak herhangi bir tarama çabaları başarısı seçimi ve kullanılabilirlik bir yüksek kaliteli protein kitaplığının bağlıdır unutulmamalıdır. İlgili ekstraselüler proteinlerin seçim ölçütlerini daha önce yayımlanmış4,22olmuştur. Tahmin ilgili protein özellikleri (örneğin transmembran sarmal veya sinyal peptidler) için yararlı araçlar bir dizi online, serbestçe kullanılabilir aşağıdaki sunucuları da dahil olmak üzere: SignalP15, TMHMM16, Phobious17ve TOPCONS 18. mükemmel yöntemleri kağıtları benzeşme arıtma yöntemleri açıklayan başka bir yerde kullanılabilir. Ayrıca Mikroarray protein Kütüphane üretimi protein ECDs üretim çözünür rekombinant ürünler olarak kullanır ve bu nedenle çalışmalar bu yaklaşım sağlar belirtilmelidir tip ı, tip II ve GPI bağlantılı hücre yüzey reseptörleri ve salgılanan proteinler, ama genellikle için uygun değildir multitransmembrane içeren protein G protein birleştiğinde reseptörleri gibi. Proteinler yüzlerce arıtma rekombinant çözünür proteinler olarak önemli lojistik çabaları talepleri ve çok kaynak - ebilmek var olmak ve zaman alıcı. Yine de, gene sentezi azalmıştır maliyeti ve protein arıtma sistemlerinin artan işlem hacmi ile Kütüphane üretimi nispeten daha hızlı ve daha uygun fiyatlı şimdi. Alternatif olarak, ticari kaynakları küçük gereksinimleri slayt yazdırmak için verilen bir dayanıklı protein mikroarray kitaplığının üretimi için yeterli mikrogram miktarlarda satın arıtılmış hücre dışı proteinler sunuyoruz. Bu sınırlamalar rağmen Mikroarray teknoloji protein reaktifler, hızlı dökümanları (yeni PPIs 1 gün içinde tespit edilebilir) ve uygun fiyatlı araçları en az tüketim gibi büyük avantajlar sunuyor. Buna ek olarak, yapıları ve arıtma koşulları kurduktan sonra küçük ölçekli purifications diziler binlerce hazırlamak için yeterli malzeme üretebilir.
Son olarak, bazı durumlarda, nispeten yüksek arka plan, birçok protein mikroarray kitaplığını bağlama olarak beliren görülmektedir. Non-spesifik bağlayıcı etkisi birden fazla faktör vardır. Örneğin, bazı proteinler yüksek ücret olabilir veya karbonhidrat, non-spesifik arka yoluyla ortak motifler tanınması için muhasebe ile etkileşim. Benzer şekilde, non-spesifik bağlama de örneğin sialik asit motifleri, tanınması gibi sorgu protein yapısı nedeniyle birden çok diğer proteinler arasında bulunabilir. Mikroarray kitaplıkları geliştikçe daha yüksektir non-spesifik bağlayıcı ortak listesi mevcut olabilecek. Böyle belirsiz bağlayıcı karşı ilgisiz sorgu proteinler çeşitli ekranlar karşısında davranışlarını izleme tarafından tespit edilebilir. Belirli vurmak arama geliştirmek için ekranlar arasında non-spesifik bağlayıcı bir listesini oluşturmak için tavsiye edilir. Bizim durumumuzda, % 5 kesme (bir protein bağlayıcı %5 veya daha fazla ilişkili olmayan sorgu protein ekranlar gibi algıladıysa non-spesifik işaretleniryani ) uygulama yanlış pozitif azaltmak önemli olduğunu bulduk. Bu deneyleri temel amacı sadece birkaç seçili ekranları çalıştırmak için ise, bu bir istatistiksel analiz geliştirmek için değerli olmayabilir unutulmamalıdır. Bu durumda, yanlış pozitif sınırlı bir veri kümesi nedeniyle tespit etmek mümkün olmayabilir ve bu nedenle biz özel vurgu alternatif yöntemler kullanarak sayısı onayında yerleştirilir öneririz.
Biz hücre dışı protein microarrays, özellikle multimerization yöntemleri geçici reseptör-ligand etkileşimleri, tespiti ile birlikte hızlı ve sağlam kimliği roman PPI için benzersiz bir platform sunmak devam edecek tahmin ekstrasellüler boşluk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., S.R-R ve N.M-M. GreenTech çalışanları ve kendi hisselerine Genentech A.ş. / Roche Grubu vardır.
Acknowledgments
Biz Philamer Calses ve Kobe Yuen eleştirel yazı okumak için teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik danışmanlık için Randy Yen için müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
