Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
De onafhankelijke expressie methanol door Pichia Pastoris ambtshalve repressie technologieën in dienst
Summary January 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Deze methode voor het eerst beschrijft betrouwbare experimentele procedures voor efficiënte afleidbare methanol-vrije recombinante eiwitproductie in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), met de koolstof bron geregeld initiatiefnemers P DCen PDF in kleine schaal experimenten terwijl teelt parameters kunnen online worden gecontroleerd, en een constante glycerol feed wordt toegepast.
Transcript
Deze methode kan helpen bij de voorselectie van chromosomen klonen door Pichia pastoris stammen uitdrukken recombinant eiwitten onder de-repressed voorwaarden door een eenvoudige shake kolf teelten voorafgaand aan schaalvergroting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat methanolvrije eiwitexpressie op hoog niveau kan worden bereikt met Pichia pastoris, wat wordt ondersteund door de exacte online monitoring van belangrijke teeltparameters. Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben omdat het tijdstip voor het starten van het glasteeltvoer moet worden aangepast aan de groeikenmerken van de specifieke productiestam.
Voor het opzetten van de hoofdcultuur, zaad een enkele verse kolonie van de expressie stam van belang in 5 ml gist pepto en dextrose bouillon in een 50 ml conische buis. Laat het deksel iets open staan om een goede beerting mogelijk te maken. Plaats de cultuur dan in een shaker op 28 graden Celsius, 80% luchtvochtigheid en 100 tot 130 RPM 's nachts.
De volgende ochtend start de software voor het aansluiten van de apparaten via Bluetooth. Druk vervolgens op de zilveren knop aan de voorkant van het biomassameetapparaat om de Bluetooth-verbinding met het apparaat in te schakelen en klik op zoekapparaten in de computerbewakingssoftware. Sleep en drop de gevonden apparaten naar de vierkanten in de meetlade en klik op connect.
Wanneer een succesvolle verbinding wordt gemaakt, verschijnt er een besturingselementscherm. Als u een experiment wilt instellen, klikt u op Meting starten. Geef het experiment een naam en controleer of alle parameters die nodig zijn voor de bewaking zijn ingeschakeld.
Stel het interval in op drie minuten en de gemiddelde meting wijst op 11. Voer de namen voor de monsters in en sla de hoekkalibratie over. Meet de celdichtheid van de nachtcultuur verdund op een één tot twintig verhouding in teeltmedium in een spectrofotometer op een golflengte van 600 nanometer.
Inenting 50 ml van het medium met de nachtelijke cultuur tot een OD 600 van 05. Plaats de kolven vervolgens vijf minuten in de detectoren op 28 graden Celsius, 130 rpm en 80%-vochtigheid. Klik op meting starten in de software.
Vier uur na de inenting, gebruik een monster van 2 ml voor de meting van de celdichtheid, zoals zojuist is aangetoond. Wanneer de zuurstofconcentratie nul nadert en de cellen op de exponentiële groeifase zijn voeg vier glycerol voerschijven aan elke fles onder steriele omstandigheden toe. Breng de kolven vervolgens 60 tot 90 uur terug naar de schuddende couveuse.
Neem elke 24 uur monsters om de celdichtheid en de eiwitexpressie te controleren door de test van keuze. Breng aan het einde van de teelt de culturen over in 50 ml conische buizen voor centrifugatie. Exporteer de online meetgegevens als een spreadsheetbestand uit de software voor verdere analyse.
In deze representatieve teelt was de beginconcentratie van glycerol 5%Hoewel de voerschijven werden toegevoegd toen de biomassa exponentieel toeneemt, daalde de zuurstof tot bijna nul. Lagere glycerolconcentraties verminderden het effect van de zuurstofbeperkingen op korte termijn en worden daarom aanbevolen voor de-onderdrukte eiwitexpressie. In dit representatieve experiment waarbij menselijk groeihormoon werd uitgedrukt onder de controle van een koolstofbron onderdrukt promotor bij glycerol uitputting van de eiwitexpressie door de-onderdrukking werd verzekerd door de toevoeging van vier voederschijven per kolf.
Zoals verwacht namen de menselijke groeihormoonexpressie en de biomassaontwikkeling in de loop van de tijd toe in aanwezigheid van de glycerolvoerschijven, terwijl de eiwitexpressie na verloop van tijd afnam en de biomassa constant bleef bij afwezigheid van het glycerolsupplement. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om zorgvuldig te observeren de teelt parameters om een optimale expressie begintijd te bepalen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals eiwitconcentratiebepaling westerse vlekanalyse of activiteitstesten worden uitgevoerd voor de evaluatie van de eiwitopbrengst en kleinschalige bioreactorexperimenten om aanvullende vragen over de prestaties van de individuele belasting op grotere schaal te beantwoorden.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van methanolvrije recombinant eiwitexpressie om een veelbelovend alternatief te verkennen voor de veelgebruikte methanolafhanol afhankelijke AOX1 promotor op Pichia pastoris.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
