Biology
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एक BW रिपोर्टर प्रणाली के अध्ययन के लिए रिसेप्टर Ligand बातचीत
Chapters
Summary January 7th, 2019
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इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रिपोर्टर प्रणाली है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित करने के लिए और रिसेप्टर ligand बातचीत ।
Transcript
शालोम. BW रिपोर्टर सिस्टम रिसेप्टर-लिगांड इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है । यह उन मामलों में अत्यंत उपयोगी है जहां एक विशिष्ट रिसेप्टर का लिगांड अज्ञात है या ऐसे मामलों में जहां अंतर्जात लिगामेंट के साथ प्रयोग तकनीकी रूप से कठिन हैं। यह विधि संवेदनशील और एक व्यक्तिगत रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है, काम करने में आसान और प्रजनन योग्य है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन शिरा कहलोन, मेरी प्रयोगशाला के लिए एक पोस्टडॉक होगा । ट्रांसफेक्शन से पहले दिन, 100, 000 BW5147 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर के साथ 10 प्लेटें प्लेटें, और एक RPMI पूरक। इसके बाद एक ट्यूब में 100 माइक्रोग्राम pcDNA3 प्लाज्मिड रखें।
ट्यूब में पीएच 5.3 पर सोडियम एसीटेट जोड़ें। इसके बाद, प्लाज्मिड मिश्रण में 100% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम जोड़ें। फिर प्लाज्मिड मिश्रण को रात भर शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
बीडब्ल्यू कोशिकाओं को चढ़ाना के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों में इकट्ठा करें। फिर पांच मिनट के लिए 515 ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को त्याग दें। पेलोटन आरपीएमआई को बिना अतिरिक्त के फिर से रीसुस्ल करें और अपकेंद्रित्र को दोहराएं।
अतिरिक्त के बिना आरपीएमआई के 1 मिलीलीटर में परिणामी गोली को फिर से खर्च करें। पुनः निलंबित गोली को बर्फ पर 4 सेंटीमीटर क्यूवेट में स्थानांतरित करें। सेंट्रलाइज प्लास्मिड जो इथेनॉल वर्षा से गुजरा।
फिर प्लाज्मिड को 70% इथेनॉल के एक मिलीलीटर से धोएं। और एक और 20 मिनट के लिए अपकेंद्री दोहराएं । सभी इथेनॉल निकालें, और गोली को आंशिक रूप से सूखने दें।
फिर बिना अतिरिक्त के प्रीहीटेड आरपीएमआई के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। इसके बाद, क्यूवेट में कोशिकाओं में पुनः निलंबित प्लाज्मिड जोड़ें। पांच मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपाउरेट करें। फिर इलेक्ट्रोपेटेड कोशिकाओं को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए पूरा माध्यम के ५० मिलीलीटर जोड़ें, ५१५ जी पर ।
सुपरनेट को त्यागें, और कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के 50 मिलीलीटर में फिर से रखें। फिर 24-अच्छी संस्कृति व्यंजनों में कोशिकाओं को प्लेट करें, और कोशिकाओं को 48 घंटे तक इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में जी418 के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक पूर्ण माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें।
48 घंटे बाद, प्रत्येक कुएं की ऊपरी मात्रा का एक मिलीलीटर त्यागें। फिर प्रत्येक कुएं में जी418 के पांच मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर के साथ पूर्ण मध्यम पूरक का एक मिलीलीटर जोड़ें। 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में, अपने वांछित लक्ष्यों के साथ 50, 000 संक्रमित बीडब्ल्यू कोशिकाओं का उपयोग करें।
48 घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट। इसके बाद प्लेट को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दें। एंटी माउस आईएल-2 एंटीबॉडी के साथ एक एलिसा प्लेट कोट करें।
प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर की मात्रा में 05 माइक्रोग्राम एंटी-माउस आईएल-2 रखें। लेपित प्लेट को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन अवधि का उपयोग करें, जमे हुए BW कोशिकाओं गल, कि पहले अपने लक्ष्यों के साथ इनक्यूबेटेड थे ।
फिर प्लेट को अपकाइज करें, और प्रत्येक कुएं से सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोलीटर को प्री-कोटेड एलिसा प्लेट में स्थानांतरित करें। और दो घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इसके बाद एलिसा प्लेट में बायोटिन एंटी-माउस आईएल-2 जोड़ें।
फिर इनक्यूबेशन और धोने के बाद, प्लेट में एचआरपी संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन जोड़ें। इनक्यूबेशन और धोने के बाद, एलिसा प्लेट के प्रत्येक कुएं में टीएमबी सब्सट्रेट समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंत में 650 नैनोमीटर पर एलिसा प्लेट पढ़ें।
इस उदाहरण में, सीएलएल कोशिकाओं को विभिन्न एंटी-सीडी 20 एंटीबॉडी के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड किया गया था। और फिर सह संक्रमित BW कोशिकाओं जो एफसी रिसेप्टर्स CD16 व्यक्त के साथ इनक्यूबेटेड, एलिसा के साथ विश्लेषण किया जा रहा से पहले । एलिसा के साथ विश्लेषण के बाद परिणामों की मात्रा निर्धारित की गई ।
ऑप्टिकल घनत्व के स्तर, मानक वक्र के आधार पर माउस आईएल-2 सांद्रता में परिवर्तित हो गए थे। एक अतिरिक्त प्रयोग में, विरोधी CD20 एंटीबॉडी की विभिन्न खुराक सीएलएल कोशिकाओं के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड थे। और फिर संक्रमित बीडब्ल्यू कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड ।
कण के चार मुख्य भाग होते हैं। क्लोनिंग, बीडब्ल्यू कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन, एक्टिवेशन और एलिसा। प्रत्येक भाग को स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए।
इस प्रक्रिया के बाद, अतिरिक्त प्रयोग कोशिकाओं के साथ किए जा सकते हैं जो अंतर्जात रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं, जैसे एनके सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एनके कोशिकाओं के साथ एसिड की हत्या। हमने एनके सेल रिसेप्टर्स के नए लिगामेंट्स की खोज के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, हेमाग्लुटिनिन एनकेपी46 का एक लिगांड है, और पीवीएल टीजी का एक लिगामेंट है।
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