Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifiering av antikroppsberoende förbättring av zikaviruset i primära mänskliga celler
Summary January 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metod för att utvärdera effekten av redan existerande immunitet mot denguefeber virus på Zika virusinfektion med humant serum, primära mänskliga celler och infektion kvantifiering genom kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion.
Transcript
Denna metod kan användas för att utvärdera effekterna av redan existerande immunitet mot denguevirus på Zika virusinfektion, med hjälp av faktiska mänskliga patienten serum och primära mänskliga immunceller. Användningen av faktiska mänskliga patienten serumprover och mänskliga primära celler ger djupare insikt i antikropp beroende förbättring av Zika virus av pre-immun sera och antikroppar. Denna metod ger insikt i antikropparnas förmåga i en patients blod att förstärka en virusinfektion i andra mänskliga celler.
Det är viktigt att se till att virusinfektionsnivåerna är tillräckligt höga för detektion men tillräckligt låg för att inte överväldiga cellerna eller störa datatolkningen. Börja med att så tre gånger tio till de fjärde cellerna i 100 mikroliter av cellodlingsmedium per brunn i en steril, platt botten 96-brunnsplatta. När alla cellerna har pläterats, placera plattan i en 37 grader Celsius och 5%koldioxid inkubator och göra 10 faldig serieutspädningar av tinade humana serumprover i serumfritt medium.
Var noga med att hålla serumutspädningarna och spädningsfaktorn konstant för alla pre-immunserumen innan spädningarna tillsätts till viruslösningarna och cellerna. Nästa, tina Zika virus stammar stamlösning i en 37 graders Celsius vattenbad i en till två minuter innan snabbt överföra beståndet till is. Lägg till en 0,1 multiplikitet av infektion motsvarande volym Zika virus till serum alikvoter och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i en timme så att denguevirus antikroppar att bilda komplex med Zika virions.
I slutet av inkubationen, tvätta cellerna med 100 mikroliter PBS per brunn och tillsätt 50 mikroliter immunkomplex till varje brunn. Efter två timmars inkubation, ta bort mediet och tvätta brunnarna två gånger med 100 mikroliter PBS per brunn för att helt ta bort immunkomplexen och eventuella obundna virioner. Mata sedan cellerna med 100 mikroliter per brunn av cellodlingsmedium kompletterat med 10%fetalt bovinserum.
Sedan tillbaka cellerna till cellodlingen inkubatorn i 48 timmar. Två dagar efter infektionen, tvätta cellerna två gånger med 100 mikroliter steril PBS per brunn innan du lägger till 250 mikroliter cell lysbuffert med 10%beta merkaptoetanol till varje brunn. Pipett upp och ner minst fem gånger med repor för att påskynda lysprocessen och överföra cellen lysas till sterila märkta 1,5 milliliter rör.
Tillsätt en lika stor volym på 70%etanol till varje rör och pipettera lysatelösningen upp och ner fyra till fem gånger. När lysateupphängningar är tydliga, överför varje lösning till märkta kiseldioxidbaserade kolumner i två milliliter uppsamlingsrör för centrifuger. Kassera genomflödet hålla kolumnerna i samma samlingsrör och tillsätt 700 mikroliter av Wash Buffer 1 till varje kolumn för en andra centrifugeringen.
Efter att du har kastat igenom flödet sköljer du kolumnerna ytterligare två gånger med 500 mikroliter Wash Buffer två per tvätt. Efter den andra tvätten överför du kolonnerna till nya två milliliter uppsamlingsrör för en annan centrifuger. Tillsätt 30 mikroliter med 42 grader Celsius RNase-Fritt vatten till mitten av varje kolumn för centrifugering och återhämta det eluerade RNA.
För kvantitativ realtids polymeras kedjereaktion eller QRTPCR analys lägga till en mikroliter av genspecifika framåt och omvänd primers från 10 mikromolar lager tillsammans med 0,25 mikroliter av omvänd transkriptas mix per reaktion. Observera att primers som känner igen Zika virus genetiskt material kommer att upptäcka virusgener och möjliggöra infektion kvantifiering. Därefter lägger 12,5 mikroliter av SYBR Green Mix följt av 25 mikroliter vatten till varje reaktion lägga 15 mikroliter av Master Mix i varje brunn av 96-väl QPCR plattan.
När du använder en Master Mix, tillsätt 100 nanogram av RNA-provet till mixen och pipettera Master Mix i enskilda brunnar av QRTPCR-plattan. Observera att prover ska köras i tre exemplar på samma QRTPCR-platta. Kör sedan proverna på en kvantitativ PCR-maskin enligt de parametrar som beskrivs i tabellen.
Klicka på fliken smältkurva i systemets programvara för att övervaka smältkurvan. Smältkurvan kommer att visa enstaka topp i alla prover för en viss gen för att bekräfta förekomsten av endast en amplikon. För optimala resultat, använd 0,5 grader Celsius temperatursteg mellan steg och en minsta hålltid på 10 sekunder i smältkurvan protokollet.
Klicka sedan på fliken kvantifieringsdata för att få en kvantitativ cykel för varje prov och exportera data till ett kalkylblad för ytterligare kvantifieringsanalys. De mänskliga serumproven kan kategoriseras i tre olika grupper:denguevirus infektion bekräftade prover, denguevirus antikropp bekräftade prover, och friska sera med ingen denguevirus neutraliserande antikroppar eller RNA. Efter 48 timmars infektion visar QRTPCR-analys att de flesta sera som innehåller denguevirusserotyp en till fyra antikroppar kan förbättra Zika-virusreplikation på olika nivåer.
Den högsta ökningen av Zika virus titrar finns i makrofager behandlas med sera-innehållande denguevirus serotyp två och fyra antikroppar jämfört med serotyp ett och tre som visar en relativt lägre induktion av Zika virus. Det är viktigt att upprätthålla en steril miljö, att bära rätt personlig skyddsutrustning, och att alltid hålla de tinade virusserumproverna och QPCR-reagenserna på is. Detta protokoll kan enkelt modifieras för att studera antikroppsberoende förbättring av andra flavivirus såsom gula febern virus, denguevirus, eller West Nile virus med hjälp av en panel av patientens serum.
Denna teknik kommer att vara mycket användbar för att utföra framtida antikroppsberoende förbättringsstudier inom arbovirus- eller virologiområdena. Korrekt utrustning för biosäkerhetsnivå två ska användas hela tiden och allt virusavfall ska saneras i 10%blekmedel under 30 minuter före bortskaffande.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
