Cancer Research
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utarbeidelse av Exosomes for siRNA levering til kreftceller
Chapters
Summary December 5th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En exosome er en ny generasjon av stoffet levering bærere. Vi etablert en exosome isolasjon protokoll med høy kapasitet og renhet for siRNA levering. Vi innkapslet fluorescently merket uspesifisert siRNA i exosomes og undersøkt mobilnettet opptaket av siRNA lastet exosomes i kreftcellene.
Transcript
Høsting eksosom-beriket betinget medium fra celler dyrket i bioreaktor kolber og isolasjon av sukrose pute ultracentrifugation resultere i eksosom preparat av høyt utbytte med minimal forurensende proteiner eller ikke-exosomale vesikler. Ved hjelp av en enkelt sukrosepute tilberedt i deuteriumoksid omgår den arbeidskrevende fremstillingen av en diskontinuerlig sukrosegradient og reduserer mengden sukrose som trengs for å oppnå den nødvendige tettheten. Effektiv in vitro levering av siRNA innkapsling i eksosomer utarbeidet i denne protokollen fremhever potensialet i dette systemet som en ny generasjon RNA interferens-basert terapi for kreft i bukspyttkjertelen.
Til å begynne, kultur HEK-293 celler i normalt medium, som beskrevet i manuskriptet. Utvid cellene til fire T75 flasker, og vokse til de når 90% samløpet. For å forberede en bioreaktorkolbe, tilsett 50 til 100 milliliter av normalt medium i det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben for å tørst membranen.
Samle alle HEK-293 celler fra de fire T75 kolben, og resuspend dem i 15 milliliter eksosom-utarmet medium i en sentrifuge rør. Deretter bruker du en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål for å forsiktig legge denne cellefjæringen til cellerommet på bioreaktorkolben. Fyll deretter det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben med det normale mediet, opptil 500 milliliter, og inkuber det ved 37 grader Celsius, 5% CO2 i en uke.
Etter en uke med inkubasjon fjerner du alt mediet fra det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben ved å helle det ut. Bruk en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål, fjern alt mediet fra cellerommet. Deretter legger du til 50 til 100 milliliter normalt medium til mellomreservoaret og 15 milliliter friskt eksosomt til cellerommet ved hjelp av en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål.
Fyll deretter det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben med normalt medium opptil 500 milliliter. Inkuber ved 37 grader Celsius, 5% CO2 for en uke. For å forhåndsklarere det innsamlede bedede besamlede mediet, sentrifuger det på 500 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius.
Overfør supernatanten til et nytt rør, og kast pelleten. Etter å ha gjentatt dette sentrifugeringstrinnet med det gjenopprettede supernatant, gjenoppretter du supernatanten igjen og kast pelleten. Deretter sentrifugere gjenvunnet supernatant på 2, 000 ganger g i 15 minutter og fire grader Celsius.
Hold overnaturanten, og kast pelleten. Filtrer supernatanten en gang gjennom et 22-mikrometerfilter festet til en 20-milliliter sprøyte i et friskt sentrifugerør. I mellomtiden, for å forberede en 25% sukroseløsning i deuteriumoksid, veier du nøyaktig ut 1,9 gram sukrose i et universelt rør.
Deretter legger deuteriumoksid til vekten når 7,6 gram. Fyll deretter opp et ultrasentrisk rør med 22,5 milliliter forhåndsklarert betinget medium. Plasser en glasspipette i røret.
Tilsett tre milliliter sukroseløsning gjennom pipetten slik at løsningen danner et eget lag under det bevisste mediet. Plasser røret som inneholder lagdelt betinget medium/sukroseløsning i bøtte med en utsvingsrotor. Fest bøtten inn i rotoren.
Plasser rotoren i ultracentrifuge, og spinn på 100, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 1,5 timer. Samle to milliliter av sukroselaget fra røret, en milliliter om gangen ved hjelp av en P1000 pipette, med spissen festet til en 10-mikroliterspiss, og legg den til en ultracentrifugeflaske som inneholder 20 milliliter filtrert PBS for vasking. Plasser røret i en fastvinkelrotor, og sentrifuger det på 100, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 1,5 timer.
Bruk en 10-milliliter serologisk pipette for å forsiktig fjerne det overnaturlige. Resuspend pellet med 400 mikroliter filtrert PBS. Før du starter elektroporasjonen, før du forkjøl elektroporasjonscuvette på is i 30 minutter.
Bland syv mikrogram eksosomer med 33 mikrogram siRNA i mikrocentrifugerøret. Tilsett sitronsyrebuffer for å oppnå volumet på 150 mikroliter. Tilsett eksosomet-siRNA-blandingen til elektroporasjonspotten ved hjelp av en plastpipette, og het cuvette.
Plasser cuvette i riktig retning i cuvette holderen av elektroporatoren, og roter dreiehjulet på elektroporatoren 180 grader med klokken. Velg ønsket program, og trykk på Start-knappen for å starte elektroporering. Displayet vil indikere en vellykket puls.
Deretter slår du hjulet 180 grader mot klokken, og fjerner cuvette. Bruk en plastpipette til å fjerne prøven fra cuvette inn i et nytt mikrocentrifugerør. Hold røret på is eller i kjøleskap før videre behandling, hvis det ikke brukes umiddelbart.
For å starte gratis fjerning av siRNA, send 3,5 milliliter filtrert PBS gjennom størrelseekskludering kromatografikolonnen to ganger for å likevekte den. Oppløs deretter 150 mikroliter elektroporer av elektroporert prøve i 350 mikroliter filtrert PBS, og overfør den til SEC-kolonnen. Samle den første 500-mikroliterfraksjonen som er eluted fra kolonnen til et mikrodrivstoffrør, og merk det som F0. Deretter legger du til 500 mikroliter med filtrert PBS i kolonnen.
Samle den neste fraksjonen, og merk den som F1. Gjenta legge PBS og samle elution fraksjoner til totalt 10 500-mikroliter fraksjoner, eller opp til F9, er samlet. Til slutt, for å fjerne eventuelle prøverester, vask kolonnen med filtrert PBS minst to ganger, og fortsett deretter med eksperimenter, som beskrevet i manuskriptet. Morfologisk analyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi viste at HEK-293 eksosomer var sfæriske strukturer litt større enn 100 nanometer.
Dette resultatet er enig med det fra nanopartikkelsporingsanalysemåling, som også viste størrelsesfordelingen av eksosomer. Videre var de positive for eksosomale markører CD81, CD9 og CD63. Den prosentvise utvinningen av eksosomer renset ved hjelp av størrelse ekskludering kromatografi og prosentvis gjenoppretting av siRNA ble beregnet som beskrevet i manuskriptet.
Etter rensing av eksosomet var 75%Ved hjelp av siRNA standardkurve, innkapslingseffektiviteten til siRNA i eksosomer ble beregnet til å være omtrent 10 til 20 % flytende cytometriqualitativ analyse av in vitro-opptak av eksosomer lastet med fluorescerende Atto655-siRNA viste at PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer hadde det største skiftet i fluorescenssignal. Det ble bekreftet av funnet at PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer registrerte en høyere prosentandel av befolkningen positivt for Atto655 signalet sammenlignet med det som ble behandlet med losset eksosomer og siRNA blanding. Cellulær opptak av siRNA var også signifikant høyere i PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer sammenlignet med det som ble behandlet med eksosomet-siRNA-blandingen, noe som bekrefter at siRNA-innkapslede eksosomer ble internalisert av PANC-1-cellene, og at de effektivt leverer siRNA intracellulært.
Det er viktig å veie sukrose og deuteriumoksid veldig nøyaktig når du forbereder sukroseløsningen, og bruk alltid nylaget sukroseløsning for å unngå tetthetsendring under lagring. Konfokal mikroskopi kan utføres for å ytterligere validere internaliseringen av siRNA innkapslet i eksosomene i celler og studere intracellulær smugling etter cellulæropptak. Denne protokollen tillater oss å vurdere den genspesifikke nedslagsen av siRNA levert av eksosom og fungerer som et verktøy for ny målvalidering i RNA interferensbasert kreftbehandling.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
