Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Etablering af Viral infektion og analyse af Host-Virus interaktion i Drosophila Melanogaster
Chapters
Summary March 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol beskriver Sådan oprettes viral infektion i vivo i Drosophila melanogaster ved hjælp af nano-injektion metode og grundlæggende teknikker til at analysere virus-værts-samspillet.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i virus-host interaktion område om, hvordan man effektivt etablere en virusinfektion i Drosophila melanogaster. Denne nanoinjektionsmetode giver mulighed for en præcis kontrol af viruss infektionsdosis og kan let anvendes på infektioner med andre mikrobielle patogener. Begynd med at vokse en gang 10 til den syvende levedygtige S2 stjerneceller pr. milliliter som løs, semi-klæbende monolayer i en 10 centimeter cellekultur skål med 10 milliliter komplet Schneiders Drosophila Medium uden yderligere kuldioxid ved 25 grader Celsius i en time.
Under inkubationen, resuspenderet frisk optøet Drosophila C Virus eller DCV til en mangfoldighed af infektion på 0,01 i en milliliter komplet medium og tilføje virus opløsning til cellekultur retter. Derefter returnere pladen til 25 grader Celsius inkubator i tre til fem dage. Virussen er klar til indsamling, når cellemorfologien ser sløret ud, og kulturmediet er fuld af sorte partikler, der indikerer celleaffald.
Bland supernatanten ved at pipettere et par gange, før hele cellekulturen overføres til et 15 milliliterrør til lysis af værtscellerne på minus 80 grader Celsius. For at generere arbejdskoncentrationer af virus, tø celle suspension i en 25 grader Celsius vandbad med konstant omrystning før pelletering af cellerester ved centrifugering. Overfør derefter supernatanten til et nyt sterilt 15 milliliterrør til vortexing og aliquot op til 200 mikroliter virusopløsning pr. rør.
For at bestemme den gennemsnitlige virus væv kultur infektiøs dosis, første frø en gange 10 til de fem S2 stjerneceller i 100 mikroliter af komplet medium i otte brønde pr kolonne i 12 rækker af en 96 brønd plade. Derefter returnere pladen til 25 grader Celsius inkubator. Tilfældigt vælge fem rør af virus fra minus 80 grader Celsius opbevaring.
Mens cellerne er ved at bundføde, fyldes 10 sterile 1,5 milliliter mikrocentrifugerør med 450 mikroliter sterilt komplet medium og tilsættes 50 mikroliter viruslager til det første 1,5 milliliterrør, der indeholder 450 mikroliter sterilt komplet medium fortyndet suspensionerne 10 gange pr. trin til den 12. Ved inkubationens afslutning tilsættes 50 mikroliter af hver fortynding til den relevante brønd i hver kolonne for det pågældende virusrør, og der tilsættes 50 mikroliter kulturmedium uden virus til en brønd pr. kolonne som den negative kontrol godt. Derefter placere pladen i 25 grader Celsius inkubator i tre dage og vurdere cytopatisk effekt af hver virus bestand under en Brightfield mikroskop på en 20X forstørrelse dagligt.
Klassificere en brønd, hvor cellerne ser sløret og mediet er fuld af fragmenter som en positiv brønd og en brønd, hvor cellen morfologi er normal som en negativ brønd. Før avl blandes grundigt 400 mikroliter på 50 mikrogram tetracyklin med fire gram frisk standard cornmeal fluefoder og placere maden på fire grader Celsius natten over for at fordampe ethanol. Næste morgen, varm maden til stuetemperatur og læg maden og 20 hunner og 10 mandlige nyligt lukkede voksne fluer ind i et avlsglas til en tre til fire-dages avlsinkubation ved 25 grader Celsius og 60% fugtighed under en normal lys/mørk cyklus.
Når nok æg er blevet lagt, indsamle den nyligt lukkede voksne fluer under en let strøm af kuldioxid og avle Drosophila igen to gange mere som netop påvist. Efter tre generationer af Tetracyclin behandling, indsamle fem fluer under en let strøm af kuldioxid og homogenisere fluerne med 250 mikroliter af dobbelt destilleret vand og et par 0,5 millimeter sterile keramiske perler. Efter et minut tilsættes 250 mikroliter 2X Buffer A til prøven til vortexing, før prøverne fryses ved minus 80 grader Celsius.
Dernæst hurtigt tø prøver fra minus 80 grader Celsius opbevaring i en 25 grader Celsius vandbad, efterfulgt af en 30-minutters inkubation i en 70 grader Celsius vandbad før udvinding af genomisk DNA og forstærke DNA ved polymerase kædereaktion i henhold til standard protokoller. Bekræft fraværet af Wolbachia 16 små RNA og wsp i hver flue homogenat ved gel elektroforese i henhold til standard protokoller. Derefter bageste Wolbachia-fri flyve bestand på standard majsmel flyve mad som påvist.
For virusinfektion, første brug et stereomikroskop og tynde kraftbefædre til at bryde spidsen af et glas kapillærnål til den passende diameter for nanoinfektion. For at samle injektoren skal du placere lofts-O-ringen og en blanker på injektorens metalstempling med den store smilehul, der vender udad. Brug en sprøjte udstyret med en 30 gauge nål til at fylde glasnålen med mineralsk olie og placere nålen gennem kraven.
Placer den større O-ring omkring bunden af kraven ca. en millimeter fra den stumpe ende af nålen, og monter nålen på injektorens stempel. Fastgør nålen på stemplet, og tryk på den tomme knap for at forlænge mikroinjektorens stempel, indtil der høres et hørbart signal. Tryk nu på fyld for at trække stemplet fem millimeter tilbage og dyppe nålen i en 100 plaque-dannende enhed viral suspension.
Ryst forsigtigt et eller mindst tre hætteglas med 20 Wolbachia-fri handosophila på injektionsskålen. Mandlige beænkede fluer foretrækkes under parring og reproduktion kan påvirke hunner. Derefter injicere brystkassen af hver flue med 50,6 nanoliters virusopløsning på den lidt lysere farvede region mellem mesopleura og pteropleura og måle DCV belastningen ved cytopatisk effekt analyse og kvantitativ RT PCR fra jorden fluer som netop påvist.
Efter injektionen overføres fluerne forsigtigt til et nyt hætteglas, og hætteglasset placeres vandret for at forhindre fluerne i at stikke sig til mediet, mens anæstesierne kommer sig. Injektionen er tidskrævende, men DCV replikation er meget hurtig, så det er meget vigtigt at skrive ned det nøjagtige tidspunkt på røret, når alle fluer fra hvert hætteglas er blevet injiceret. Virusinfektion kan fremkalde cellelysis og cytopatiske virkninger er observeret på tre dage efter infektion.
Wolbachia 16s rRNA og wsp primere kan bruges til at opdage tilstedeværelsen af Wolbachia og Drosophila som påvist. Wolbachia-fri fluer udviser en signifikant nedsat overlevelsesrate efter DCV-infektion og på en dosisafhængig måde. DCV aktiverer antivirale signalveje i værten, som er afgørende for antiviral infektion i Drosophila, hvilket fremgår af den nedsatte overlevelsesrate og øget viral belastning i Dicer-2 mutant fluer.
Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske, at forurening med Wolbachia genotype kan påvirke følsomheden af Drosophila melanogaster flyver til DCV infektion. Efter denne procedure, andre metoder som en større skala genetisk skærm kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om under definerede vært gener, der kræves for virusinfektion eller antivirale reaktioner. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for human virussygdom til at udforske de mekanismer, der ligger til grund for udbrud af endemiske menneskelige virusinfektioner i Drosophila melanogaster model.
Glem ikke, at arbejde med virus kan være yderst farligt, og at forholdsregler såsom at bære passende beskyttelsesudstyr bør altid tages, mens du udfører denne procedure.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
