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Immunology and Infection

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JoVE Journal Immunology and Infection

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Journal (Immunology and Infection)

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Journal (Immunology and Infection)

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Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Article DOI: 10.3791/58845-v

March 14th, 2019 •

Shuo Yang*^1,2,3, Yaya Zhao*^1,2, Junjing Yu⁴, Zhiqin Fan², Si-tang Gong¹, Hong Tang^1,2, Lei Pan^1,2,3

¹The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, ²CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, ³CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, ⁴Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

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March 14th, 2019

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Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Transcript

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’interaction virus-hôte sur la façon d’établir efficacement une infection virale chez Drosophila melanogaster. Cette méthode de nanoinjection permet un contrôle précis de la dose d’infection du virus et peut être facilement appliquée aux infections par d’autres agents pathogènes microbiens. Commencez par cultiver une fois 10 à la septième cellule S2 viable par millilitre comme monocouche lâche et semi-adhérente dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres avec 10 millilitres de drosophile moyen complet de Schneider sans dioxyde de carbone supplémentaire à 25 degrés Celsius pendant une heure.

Pendant l’incubation, resuspendez le virus Drosophila C ou DCV fraîchement décongelé à une multiplicité d’infection de 0,01 dans un millilitre de milieu complet et ajoutez une solution virale aux plats de culture cellulaire. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur de 25 degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Le virus est prêt pour la collecte lorsque la morphologie cellulaire semble floue et que le milieu de culture est plein de particules noires révélatrices de débris cellulaires.

Mélanger le supernatant en pipetant à quelques reprises avant de transférer toute la culture cellulaire à un tube de 15 millilitres pour la lyse des cellules hôtes à moins 80 degrés Celsius. Pour générer des concentrations de travail de virus, décongeler la suspension cellulaire dans un bain d’eau de 25 degrés Celsius avec des secousses constantes avant de pelleter les débris cellulaires par centrifugation. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres pour le vortex et aliquot jusqu’à 200 microlitres de solution virale par tube.

Pour déterminer la dose infectieuse moyenne de culture de tissu de virus, première graine une fois 10 aux cinq cellules d’étoile de S2 dans 100 microlitres du milieu complet dans huit puits par colonne dans 12 rangées d’une plaque de puits 96. Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de 25 degrés Celsius. Sélectionnez au hasard cinq tubes de virus de moins 80 degrés Celsius de stockage.

Pendant que les cellules se tassent, remplissez 10 tubes stériles de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre avec 450 microlitres de milieu complet stérile et ajoutez 50 microlitres de stock de virus au premier tube de 1,5 millilitre contenant 450 microlitres de milieu complet stérile diluant les suspensions 10 fois par étape jusqu’au 12e puits. À la fin de l’incubation, ajouter 50 microlitres de chaque dilution au puits approprié dans chaque colonne pour ce tube de virus et ajouter 50 microlitres de milieu de culture sans virus à un puits par colonne que le puits de contrôle négatif. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de 25 degrés Celsius pendant trois jours et évaluez l’effet cytopathique de chaque stock de virus sous un microscope Brightfield à un grossissement de 20 X par jour.

Classez un puits dans lequel les cellules semblent floues et le milieu est plein de fragments comme un puits positif et un puits dans lequel la morphologie cellulaire est normale comme un puits négatif. Avant la reproduction, bien mélanger 400 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline avec quatre grammes de nourriture fraîche standard de mouche de semoule de maïs et placer les aliments à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour évaporer l’éthanol. Le lendemain matin, réchauffez la nourriture à température ambiante et placez la nourriture et 20 mouches adultes femelles et 10 mâles nouvellement enfermés dans un flacon reproducteur pour une incubation de reproduction de trois à quatre jours à 25 degrés Celsius et 60% d’humidité sous un cycle normal lumière/obscurité.

Lorsque suffisamment d’œufs ont été pondus, recueillir les mouches adultes nouvellement fermées sous un flux léger de dioxyde de carbone et élever la Drosophile à nouveau deux fois de plus comme il vient de le démontrer. Après trois générations de traitement à la tétracycline, recueillir cinq mouches sous un léger flux de dioxyde de carbone et homogénéiser les mouches avec 250 microlitres d’eau distillée double et quelques perles de céramique stériles de 0,5 millimètre. Après une minute, ajouter 250 microlitres de tampon A 2X à l’échantillon pour le vortex avant de congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, décongelez rapidement des échantillons de moins 80 degrés Celsius dans un bain d’eau de 25 degrés Celsius, suivi d’une incubation de 30 minutes dans un bain d’eau de 70 degrés Celsius avant d’extraire l’ADN génomique et d’amplifier l’ADN par réaction en chaîne de polymése selon les protocoles standard. Confirmer l’absence de Wolbachia 16 petits ARN et wsp dans chaque mouche homogénéisé par électrophoresis gel selon les protocoles standard. Puis élever le stock de mouches sans Wolbachia sur la nourriture standard de mouche de semoule de maïs comme démontré.

Pour l’infection virale, utilisez d’abord un stéréomicroscope et des forceps minces pour briser la pointe d’une aiguille capillaire en verre au diamètre approprié pour la nanoinjection. Pour assembler l’injecteur, placez l’anneau O du plafond et un espaceur blanc sur le piston métallique de l’injecteur avec la grande fossette orientée vers l’extérieur. Utilisez une seringue munie d’une aiguille de calibre 30 pour remplir l’aiguille en verre d’huile minérale et placer l’aiguille à travers le collier.

Placez l’anneau O plus grand autour de la base du collier à environ un millimètre de l’extrémité émoussée de l’aiguille et montez l’aiguille sur le piston de l’injecteur. Fixez l’aiguille sur le piston et appuyez sur le bouton vide pour prolonger le piston du microinjecteur jusqu’à ce qu’un signal sonore soit entendu. Maintenant, appuyez sur remplir pour rétracter le piston de cinq millimètres et tremper l’aiguille dans une suspension virale unité de formation de plaque de 100.

Agiter délicatement un ou au moins trois flacons de 20 drosophiles mâles sans Wolbachia sur le plat d’injection. Les mouches dotées de mâles sont préférées lors de l’accouplement et la reproduction peut influencer les femelles. Injectez ensuite le thorax de chaque mouche avec 50,6 nanolitres de solution virale dans la région légèrement plus claire entre la mésopleura et la pteropleura et mesurez la charge de DCV par analyse d’effet cytopathique et RT PCR quantitatif à partir de mouches au sol comme nous venons de le démontrer.

Après l’injection, transférez soigneusement les mouches dans un flacon frais et placez le flacon dans une position horizontale pour empêcher les mouches de coller au milieu tout en se remettant de l’anesthésie. L’injection prend beaucoup de temps, mais la réplication DCV est très rapide, il est donc très important d’écrire l’heure exacte sur le tube une fois que toutes les mouches de chaque flacon ont été injectés. L’infection virale peut induire une lyse cellulaire et des effets cytopathiques sont observés trois jours après l’infection.

Wolbachia 16s rRNA et wsp amorces peuvent être utilisés pour détecter la présence de Wolbachia et Drosophila comme démontré. Les mouches sans wolbachia présentent un taux de survie significativement diminué après l’infection par le DCV et d’une manière dépendante de la dose. Le DCV active les voies de signalisation antivirales chez l’hôte qui sont critiques pour l’infection antivirale à Drosophila, comme en témoigne la diminution du taux de survie et l’augmentation de la charge virale chez les mouches mutantes Dicer-2.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la contamination avec le génotype de Wolbachia peut affecter la susceptibilité du melanogaster de Drosophila vole à l’infection de DCV. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme un dépistage génétique à plus grande échelle peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions sur les gènes hôtes sous-définis requis pour l’infection virale ou les réponses antivirales. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des maladies virales humaines pour explorer les mécanismes sous-jacents aux flambées d’infections virales humaines endémiques dans le modèle melanogaster Drosophila.

N’oubliez pas que travailler avec le virus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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