Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
كريسبر Cas تقنية قوية هندسة الجينوم معقدة من النباتات والحيوانات. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لكفاءة تحرير الجينوم البشري باستخدام مختلف Cas اندونوكليسيس. نسلط الضوء على الاعتبارات الهامة ومعايير التصميم لتحسين كفاءة التحرير.
Transcript
يستخدم هذا البروتوكول CRISPR-Cas9 لإنشاء خطوط خروج المغلوب أو خروج المغلوب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه من السهل والكفاءة لمتابعة خاصة بالنسبة للباحثين المبتدئين. بالنسبة لـ الخلايا، قم بمعالجة الخلايا المستزرعة بين عشية وضحاها بمليلترين بنسبة 0.25٪ لتربيتين EDTA لكل صفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
عندما تكون الخلايا قد رفعت من قيعان لوحة، تحييد رد فعل انزيمي مع ملليلتر اثنين من خلية ثقافة المتوسطة، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من خلية جديدة ثقافة المتوسطة للعد. ثم البذور 1.8 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في بئر واحد من 24 بئرا لوحة ثقافة الأنسجة لثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بالنسبة لtransfection من الخلايا، إضافة حجم مناسب من المزيج transfection التي تحتوي على التركيز المناسب من البلازميد CRISPR إلى الحجم المناسب من كاشف transfection، وفقا للتصميم التجريبي وتعليمات الشركة المصنعة. بعد احتضان مزيج transfection في درجة حرارة الغرفة لفترة الموصى بها من الزمن، إضافة الحل إلى الخلايا بطريقة قطرة الحكمة. ثم تدور بلطف لوحة لخلط ووضع لوحة في حاضنة درجة مئوية مرطبة 37 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في نهاية transfection، إضافة 150 ميكرولترات من تريبسين-EDTA لفصل الخلايا كما أظهرت للتو وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مصل البقر 2٪ الجنين في PBS وتصفية الخلايا من خلال 30 ميكرومتر شبكة مصفاة في خلية خمس ملليلتر تنشيط الفلورانس الفرز، أو أنبوب FACS. ثم استخدام الخلايا غير المُزوَّرة لتعيين بوابة تحكم سلبية على مقياس التدفق وفرز الخلايا المُزوّرة وفقاً لعلامة الفلورسنت على الـ CRISPR plasmid المستخدم في عملية نقل العدوى إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولترات من خلية متوسطة.
عندما تم جمع جميع الخلايا المصابة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في السرعة القصوى وإعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة. بذور 200 ميكرولتر من الخلايا في بئر واحد من لوحة ثقافة الأنسجة 24 جيدا والسماح للخلايا لاسترداد لبضعة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية. بيليه المتبقية 100 ميكرولترات من الخلايا فرزها في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق واستخراج الحمض النووي الجينومي من بيليه الناتجة وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية.
بعد ذلك ، إضافة 10 ميكرولترات من البوليميراز العازلة تفاعل سلسلة ، وميكر واحد من مزيج ديوكسينويكليوتيد ، 2.5 microliters من التمهيدي العكسي المحدد من قبل المستخدم ، 0.5 ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي ، واثنين إلى خمسة ميكرولترات من قالب الحمض النووي الجينوم المستخرج وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق التفاعل إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر. تشغيل الخليط على دورة حرارية وحل التفاعل على هلام agarose 2٪ باستخدام 1X TAE العازلة وفقا للبروتوكولات القياسية. استخدام مشرط نظيفة، حادة لاستخلاص من سلسلة البوليميراز رد فعل المنتج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قياس تركيز المنتج باستخدام مقياس الطيفي في امتصاص 260 نانومتر. إعداد مزيج تحليلي يحتوي على 200 نانوغرام من الحمض النووي المعزول، واثنين من ميكرولترات من T7 endonuclease I العازلة رد فعل، وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق الحجم النهائي للخليط إلى 19 ميكرولترات. Reanneal تفاعل البوليميراز سلسلة المنتج في دورة حرارية في المعلمات المشار إليها وخلط خمس وحدات من T7 endonuclease الأول مع المنتج reannealed لاحتضان 50 دقيقة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، حل الحمض النووي هضم على هلام agarose 2.5٪ باستخدام 1X TAE العازلة، وصورة الجل على نظام التصوير هلام المناسبة. افتح صورة الجل في ImageJ وارسم مربع مستطيل حول النطاق أقرب إلى حده قدر الإمكان. انقر فوق تحليل، ثم قم بتعيين القياسات، مع التأكيد على أن المساحة، والقيمة الرمادية المتوسطة، وخيارات الكثافة المتكاملة قد تم تحديدها.
انقر فوق موافق، وحدد تحليل، وقياس. متوسط، أو قيمة كثافة كثافة الخام، يدل على كثافة الفرقة. عندما تبدأ الخلايا المُعدة للثقافة في أن تصبح اُكتبسة، افصلها بالتريبسين-EDTA، كما هو موضح، وبذّر الخلايا بشكل متفرق في طبق ثقافة الأنسجة 100 ملليمتر للسماح بمساحة كافية للمستعمرات الفردية للنمو قبل إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.
عندما تبدأ المستعمرات في التشكل، استخدم المجهر مع التكبير 4 X لاختيار المستعمرات الفردية لنقلها إلى آبار فردية من لوحة 24-well تحتوي على 500 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة في بئر. الحرص على أن تلميح الخاص بك لا تلمس المستعمرات المحيطة بها لمنع خلط المستعمرات داخل الآبار الفردية أو اختيار من منطقة من نمو مستعمرة متفرق. عندما تم اختيار جميع المستنسخين ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية حتى تصبح الثقافات التقاء.
كما البلازميدات غير المهضومة هي فائقة ملفوف، فإنها تميل إلى تشغيل أسرع من نظرائهم خطي. لتحديد ما إذا كان قد تم استنساخ oligonucleotides بنجاح في العمود الفقري كريسبر plasmid، يتم تنفيذ PCR مستعمرة ويتم تلقيح المستنسخات الإيجابية قبل استخراج البلازميدات وإرسالها لتسلسل سانجر. يمكن تصور إشارة الفلورسنت بسهولة تحت المجهر عند التسليم الناجح للـ بلازميدات ، مما يسمح للخلايا المصابة بالعدوى أن يتم فرزها حسب قياس التدفق.
يتم إجراء فحص T7 endonuclease I للتحقق من كفاءة الانقسام من الحمض النووي الجينومي ، كما تم حسابه من شدة الفرق الملاحظة على هلام agarose. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم تصميم تجربة مستندة إلى إصلاح موجهة من homology لدمج موقع تقييد في موضع الهدف، يمكن إجراء تحليل تعدد أشكال طول جزء القيد مع إنزيم تقييد المقابلة. لمزيد من التحقق من صحة أن جين ترميز البروتين قد تم تعطيل بنجاح، يمكن تنفيذ لطخة الغربية لضمان عدم وجود البروتين المستهدف.
فرز الخلايا بعد transfection يزيل الخلايا دون البلازميدات المدمجة، وبالتالي زيادة النسبة المئوية للخلايا فحص في مراحل لاحقة كما وجود خروج المغلوب أو ضرب في الجينات. مع تطور هذه التقنية ، ونحن الآن قادرون على إنتاج خطوط الخلايا خروج التدريجي لدراسة وظيفة الجينات وخطوط الخلايا ضرب في نموذج أمراض معينة لفهم آلياتها.
Tags
علم الوراثة، 146 مسألة، كريسبر، Cas9، Cas12a، تحرير الجينوم، الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة، وإصلاح الموجه من التماثلRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
