الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

في هذا البروتوكول، يمكننا تحديد التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي، والكشف عن التنظيم النسخي للجين. وهذا يساعد على فهم الآليات الجزيئية في الخلايا. نقوم بتعديل البروتوكولات الموجودة من قبل ومن ثم إنشاء بروتوكولات فحص واضحة وواضحة.

يمكنك ببساطة اتباع البروتوكول من الخطوة الأولى بحيث يمكن إجراء الفحص بنجاح. لإعداد كروماتين عبر الصلصال، في غطاء الدخان، إضافة أربعة ملليلتر من 1٪ VCaP وسائل الإعلام ثقافة الخلية و 0.229 ملليلتر من 18.5٪ PFA إلى طبق ستة سنتيمترات. دوامة بلطف الطبق لتوزيع PFA بالتساوي.

احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة بالضبط. ثم، إضافة 0.47 ملليلتر من محلول الجليسين 1.25-مولر إلى الطبق، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لوقف مزيد من الربط المتبادل. بعد غسل الخلايا وفقا للمخطوطة، كشط الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروسنتريفوغ 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي أنبوب مع تعليق الخلية في 3،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لاسترداد بيليه الخلية. استخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني تماما. سجل رقم الخلية لكل أنبوب، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية.

لأداء تحلل الخلية، أولا ذوبان الكريات خلية VCaP المخزنة على الجليد. إضافة 300 microliters من الخلية ChIP إعداد العازلة تحلل تكملة مع الموافقة المسبقة عن علم إلى كل أنبوب، وإعادة ربط بيليه بدقة. دوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية، واحتضان تعليق على الجليد لمدة 10 دقائق.

جهاز طرد مركزي في 9،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة supernatant تماما، وإضافة 300 ميكرولترات من المخزن المؤقت الهضم MNase إلى resuspend بيليه. تخفيف MNase مع MNase الهضم العازلة في أنبوب 1.5 ملليلتر لتحقيق 50 وحدات هلام لكل ميكرولتر.

أضف MNase المخفف إلى التعليق ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بالضبط. تعيين خلط عن طريق عكس كل 2 1/2 دقيقة. لإنهاء الهضم MNase، إضافة 30 ميكرولترات من 0.5-EDTA مولا في ثمانيه pH، ودوة لفترة وجيزة.

بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد، والطرد المركزي في 9،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة supernatant تماما، وإعادة فرض بيليه في 300 ميكرولترات من العازلة تخفيف ChIP المعدة تكملها الموافقة المسبقة عن علم. ثم، على sonicator مجهزة مسبار microtip، تعيين شروط sonication إلى السعة اثنين، الوقت معالجة 15 ثانية، نبض على خمس ثوان، ونبض قبالة 30 ثانية.

سونيكات التعليق على الجليد. رسم ميكرولتر واحد من التعليق، وعلى الفور على الزجاج الشريحة. تحت المجهر، لاحظ للتأكد من أن هيكل الخلية مكسورة تقريبا.

الطرد المركزي الأنبوب في 9، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، ونقل سوبرانت إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge. حفظ 20 ميكرولترات من الكروماتين هضمها في أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر لمزيد من العلاج, وتخزين ما تبقى في ناقص 80 درجة مئوية. أولاً، في كل أنبوب برغي 1.5 ملليلتر، أضف 75 ميكرولترات من الماء، وأربعة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الخماسي، وميكر واحد من البروتينات K.To إزالة الربط المتبادل بين البروتين والحمض النووي، أضف 20 ميكرولترات من الكروماتين المهضم من كل حالة هضم MNase إلى أنبوب برغي.

أغلق الغطاء بإحكام، اخلطي تماما، وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في الصباح، بعد الطرد المركزي للأنبوب في 2-3، 000 مرات ز لبضع ثوان، إضافة 100 ميكرولترات من PCI. دوامة بقوة لتشكيل مستحلب.

الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم, إعداد اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لكل حالة. إضافة 100 ميكرولترات من PCI إلى أنبوب واحد.

إضافة 10 ميكرولترات من خلات الصوديوم ثلاثة المولر في الأسك 5.2 واثنين من ميكرولترات من الجليكوجين إلى أنبوب آخر. من الأنبوب الذي تم إخراجه من جهاز الطرد المركزي، قم برسم المرحلة العليا التي تحتوي على الحمض النووي بعناية وإضافتها إلى الأنبوب الذي يحتوي على PCI. دوامة بقوة، والطرد المركزي أنبوب في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، نقل المرحلة العليا إلى أنبوب يحتوي على خلات الصوديوم والجليكوجين أعدت سابقا. إضافة 250 ميكرولترات من الإيثانول، ومزيج من الانقلاب. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

جهاز طرد مركزي الأنبوب في السرعة القصوى لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. تأكيد الكريات على الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية من عظمى حتى لا يزعج بيليه، وإضافة 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول.

جهاز طرد مركزي الأنبوب في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة ناظر تماما، وتجفيف بيليه لمدة خمس دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من TE إلى حل بيليه.

قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. بعد إعداد الكروماتين المهضم ، ذوبان جميع العينات على الجليد. إضافة 1200 ميكرولترات من العازلة تخفيف ChIP المعدة تكملها الموافقة المسبقة عن علم لتخفيف الكروماتين هضمها إلى تركيز خمسة ميكروغرام لكل 500 ميكرولترات.

إضافة خمسة ميكرولترات من الكروماتين المهضمة المخففة إلى أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر كعينة المدخلات. تخزين العينة في ناقص 80 درجة مئوية. أضف 500 ميكرولترات كل من الكروماتين المهضم المخفف إلى أنبوب برغي 1.5 ملليلتر كعينة مناعية.

إضافة اثنين من ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل أنبوب، وإغلاق الغطاء. احتضان الأنابيب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الاختلاط بلطف على منصة هزاز. في الصباح، إضافة 30 ميكرولترات من ChIP من الدرجة البروتين G الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب.

احتضان الأنابيب مرة أخرى في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين مع خلط لطيف. بعد ذلك، تدور أسفل الأنبوب لفترة وجيزة في 2-3، 000 مرات ز، ووضع الأنبوب في رف البولي إيثيلين التي تحتوي على مغناطيس النيودميوم لمدة دقيقة واحدة. ثم، إزالة بعناية فائقة من الطموح.

المقبل, إضافة 0.5 ملليلتر من انخفاض الملح منيع مجمع عازلة غسل لكل أنبوب. دوامة لفترة وجيزة الأنبوب لتفريق الخرز. احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق مع خلط لطيف على منصة هزاز.

كرر الغسيل مع مجمع المناعة عالي الملح ومجمع مناعي كلوريد الليثيوم وفقًا للمخطوطة. بعد إزالة ما تبقى من عظمى تماما، إضافة 150 ميكرولترات من عازلة elution إلى الأنبوب. دوامة الأنبوب لتفريق الخرز تماما.

أغلق الغطاء، وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتفريق الخرز جيدا، مزيج من قبل عكس كل خمس دقائق. أثناء الحضانة، إعداد أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر، وإضافة ستة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولر واثنين من microliters من البروتينات K.Thaw عينة 1٪ مدخلات أعدت سابقا على الجليد.

إضافة 150 ميكرولتردات من عازلة elution، وستة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولار، واثنين من microliters من البروتينات K إلى عينة المدخلات. بعد حضانة أنبوب يحتوي على الخرز ، تدور أسفل. وضع الأنبوب في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، ونقل عظمى إلى أنبوب المسمار التي تحتوي على كلوريد الصوديوم والبروتينات K.ممثل microphotos من الكريات خلية عبر الربط قبل وبعد سونيكيشن تظهر اختلافات متميزة.

بدون صوتنة، لا يزال هيكل الخلية سليمة، مما يشير إلى أن الكروماتين موجود في النوى. و sonication وجيزة يكسر بنية الخلية. تم إعداد الكروماتين المتداخلة من خلايا VCaP وهضمها بكميات مختلفة من MNase.

دون إضافة MNase، ظهر نمط مسحة مع وزن جزئي مرتفع جدا. أعطى إضافة من MNase نمط سلم, مما يدل على أن MNase هضم internucleosome. يمكن اعتبار الحالة الوحيدة التي أنتجت شظايا الكروماتين تصل إلى 900 BP هضم مناسب ، في حين أن نمط الهضم غير الملائم يظهر إفراط في الهضم أدى بشكل رئيسي إلى إنتاج مونونووزوم.

نمط الهضم من الكروماتين في خلايا VCaP تشير إلى الهضم السليم من الكروماتين. ولوحظ أن أعلى شغل لـ H3K4methyl3 قد لوحظ حوالي 0.5 كيلوبيس وقاعدة كيلو واحدة في المنبع من AR-TSS. المناطق الواقعة في 19 كيلوبيس و8 كيلو بايت المنبع و 12 كيلوبيس أسفل المصب من AR-TSS، ومع ذلك، كان شغل القليل من H3K4methyl3، مما يشير إلى أن هذه يمكن استخدامها كالمناطق السلبية.

تحديد حالة الهضم MNase هو الأكثر أهمية. الاحتفاظ برقم الخلية وحجم المخزن المؤقت ومقدار الإنزيم في كل تجربة. يجب تحديد الشرط لكل نوع خلية.

يمكننا إجراء تسلسل ChIP للإشغال العالمي للعوامل والتقاطات التشطيب الكروماتين لتحديد التفاعلات بين الآفات الجينومية البعيدة. ويمكن أن تكشف هذه الطريقة عن آليات عملية النسخ. ChIP المقايسة هو أداة قوية للتحقيق في التنظيم النسخي ، لكنه مرهق وغير قابل للتكرار.

طريقتنا تشجع الباحثين على إجراء الفحص بشكل روتيني وبسهولة.