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Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle
Chapters
Summary February 3rd, 2020
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Per osservare l'ultrastruttura della sensilla degli insetti, nello studio è stata presentata la microscopia elettronica di scansione e trasmissione (rispettivamente SEM e TEM). Tween 20 è stato aggiunto nel fissativo per evitare la deformazione del campione nella microscopia seM.
Transcript
Scarabeo woodboring la loro superficie corporea è sempre dura in SEM. L'Tween-20 viene aggiunto in soluzione fissante e di lavaggio. La superficie corporea dello scarabeo di woodboring In TEM, l'Tween-20 può migliorare la penetrazione fissativa nella parete corporea e fissare meglio il tessuto e l'organo nel corpo.
Il microscopio a fluorescenza è utile per migliorare la precisione di affezione. La tecnica è utile per lavare la superficie corporea e penetrare nella parete del corpo nello scarabeo che lo fa. Pertanto, chiarirebbe la visione SEM e TEM.
Il microscopio a fluorescenza è utile per migliorare la precisione di affezione in TEM. A dimostrare la procedura sarà Zhang Yanru, uno studente laureato del nostro laboratorio. In un'area in cui vive il cloroforo caragana, posiziona trappole da campo esche con attrattivi vegetali come l'isoforo su una trappola di imbuto.
Attira gli adulti coleotteri in legno nelle trappole. Conservare i corpi puliti di cloroforo caragana adulto in PBS da 0,1 mole per litro a pH 7,2, 2,5% di peso in volume glutaraldeide e 0,06% volume per volume Tween-20. Fissare il campione a quattro gradi Celsius per tre giorni.
Rimuovere i corpi dal liquido di conservazione e risciacquare in PBS. Al microscopio stereo, utilizzare le forcep per rimuovere le appendici e pulirle ad ultrasuoni a 40 kilohertz in PBST. Dopo aver pulito per 100 secondi, trasferire il campione al microscopio per verificare se è pulito.
Non pulire più di 400 secondi per evitare danni. Quindi immergere i campioni in etanolo a una serie di concentrazioni per 20 minuti ciascuna per eseguire la disidratazione. Dopo la disidratazione, al microscopio stereo, utilizzare nastro adesivo a doppia aspetto in carbonio per fissare separatamente tre superfici di osservazione, dorsale, ventrale e laterale, sugli stub.
Assicurarsi che tutte le superfici di visualizzazione siano mantenute pulite e libere da contaminazioni. Posizionare la fase del campione in una piastra di Petri contenente un essiccante in gel di silice per 48 ore. Successivamente, su uno strumento di sputtering ionio, ruotare la valvola principale in posizione aperta, rimuovere il coperchio della camera campione e mettere il campione nella camera.
Accendere l'interruttore di alimentazione e assicurarsi che la luce pronta sia attiva. Impostare il tempo di sputtering su 45 secondi e lo spessore del rivestimento come 70.875 angstrom. Una volta che l'indice del quadrante del vuoto della pompa meccanica scende sotto le sette, premere lo scarico e iniziare a spruzzare platino.
Al termine della procedura, spegnere l'alimentatore e esegni il campione dalla camera. Calcolare lo spessore della pellicola spray D in angstrom uguale a K per I per V per T.K è una costante determinata dal metallo e dal gas sputtered. I è il flusso plasmatico in milliarti mentre V è la tensione applicata in kilovolt e T è il tempo in secondi.
Inserire lo stub contenente il campione sullo stage del SEM. Assicurarsi che la fase di campionamento con lo stub del campione abbia un'altezza sufficiente per consentire una buona immagine. Aprire il software SEM e selezionare la tensione operativa desiderata a partire da 20 kilovolt.
Dopo aver ottenuto le appendici dal cloroforo caragana adulto, lavare i campioni in PBST in un bagno ad ultrasuoni per tre ore e quindi post-fissarli in peso dell'1% in volume di tetrossido di osmio in PBS per un'ora a 25 gradi Celsius. Disidratare i campioni utilizzando trattamenti successivi di 20 minuti in 50%60%70%80%85%90%95%100% e 100%volume in volume etanolo a temperatura ambiente. Con le forcep, applicare la resina riscaldata in uno stampo di incorporamento piatto e incorporare i campioni nella resina.
Assicurarsi che il campione si trova nella parte inferiore della piastra e posizionato il più vicino possibile al bordo della scanalatura incassata. Etichettare e quindi incubare la piastra contenente il campione a 60 gradi Celsius per 72 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore e verificare che la resina si sia polimerizzata.
Una volta che il campione si è solidificato, posizionare ogni blocco di resina sotto un microscopio a fluorescenza, spostare la sorgente luminosa fluorescente del microscopio per irradiare il campione con luce blu dall'alto e fotografarli. Assicurarsi che la sensilla nel blocco di resina sia chiaramente visibile. Misurare la distanza tra il bordo del blocco di resina e il sensore di destinazione per indirizzare la sensilla.
Fare riferimento all'immagine SEM dei palpi e tagliare grossolanamente il blocco di resina con una lama di rasoio vicino al recettore bersaglio. Successivamente, sotto una microscopia a fluorescenza a luce blu, regolare la sorgente luminosa dall'alto in modo che la sensilla sia osservata chiaramente. Aggiungere il micrometro obiettivo allo stadio del microscopio a fluorescenza.
Fotografare il blocco di resina tagliato grossolanamente e quindi utilizzare ImageJ misurare la distanza tra il bersaglio e il bordo della resina. Posizionare il campione di resina su un ultramicrotomo e tagliare sezioni spesse da 50 a 60 nanometri fino a raggiungere la posizione target. Montare le sezioni su griglie di rame a 100 maglie rivestite di formvar in piastre di Petri.
Macchiare le griglie con una soluzione filtrata satura di acetato di uranile a temperatura ambiente. Coprire le sezioni durante la colorazione per bloccare i precipitati indotti dalla luce. Macchiare per 10 minuti.
In una cappa aspirante sciacquare due volte nel 50% di metanolo, quindi due volte in acqua degassata filtrata. Posizionare gocce di citrato di piombo preparato sui quadrati delle piastre di Petri di plastica e lasciarle riposare per otto minuti. Risciacquare in acqua filtrata degassata e asciugare.
Montare le griglie su una fase di campionamento all'interno della macchina TEM. Impostare la tensione su 80 kilovolt ed esaminare le sezioni. In questo protocollo, utilizzando la soluzione detergente e fissante con Tween-20, è stata osservata un'immagine SEM chiara rispetto a quella senza Tween-20.
Con la soluzione di fissaggio Tween-20 che consente alla soluzione di fissaggio della glutaraldeide di penetrare nel tessuto, le strutture dei microtubuli sono state chiaramente viste nell'immagine TEM mentre la struttura interna del campione preparata senza Tween-20 era sfocata. Le viste trasversali continue del piolo del ramoscello di sensilla basiconica di tipo uno sui palpi mascellari mostravano che la torsa dendritica circondava i segmenti dendritici esterni e si estendeva fino al poro della punta. Sette segmenti dendritici esterni nonbrati esistevano all'interno della cavità linfatica interna del recettore che era circondata da una cavità esterna.
Il corpo tubolare era separato da una torcia dendritica da altri segmenti dendritici esterni ad ogni base della presa sensibilizzante. Nella regione ciliaria sono stati identificati otto dendriti di diametro diverso che indicano la presenza di otto neuroni bipolari. La tecnica può essere utilizzata per studiare ulteriormente la funzione dei nervi come la registrazione a singola cellula o l'ibridazione in situ.
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